培养基制作为什么要补水

A. 马铃薯培养基的制作过程

(1)称量和熬煮

按培养基配方逐一称取去皮薯仔。薯仔切成小块放入锅中，加水1000ml，在加热器上加热至沸腾，维持20-30min，用可用2层纱布趁热在量杯上过滤，滤渣弃取。滤液补充水分到1000ml。

(2)加热溶解

把滤液放入锅中，加入葡萄糖20g，琼脂15～20g(提前搞碎)，然后放在石棉网上，小火加热，并用玻棒不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，待琼脂完全溶解后，再补充水分至所需量。

(3)分装

按实训要求，将配制的培养基分装入试管或500ml三角瓶内。分装时可用三角漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上造成污染。

分装量：固体培养基约为试管高度的1/5，灭菌后制成斜面，分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜;半固体培养基以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

(4)加棉塞

培养基分装完毕后，在试管口或三角烧瓶口上塞上棉塞(或泡沫塑料塞或试管帽等)，以阻止外界微生物进入培养基内造成污染，并保证有良好的通气性能。

(5)包扎

加塞后，将全部试管用麻绳或橡皮筋捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道线绳或橡皮筋扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。

(1)培养基制作为什么要补水扩展阅读

防止污染应该注意以下事项：

确认工作细胞库是否被污染，确认毒种工作种子批是否被污染，确认所用培养基及其添加成分(如小牛血清、NaHCO3等)是否被污染，均可用细菌、真菌及支原体无菌试验来确认并排除。同时要对无菌试验培养基的灵敏度进行验证。实际生产中，可以从配制好的培养液中取少量加入营养琼脂于恒温培养箱内培养，48小时即可观察有无污染。

其它：高压灭菌设备、过滤除菌设备均应进行验证，确保灭菌和除菌效果;前者应在投产前及其后的每6个月进行验证，后者应在每次除菌前、后进行验证工作(至少应在除菌后进行一次)。

另外，应将有毒区与无毒区严格分开，并有各自独立的空气净化系统及孵室，有毒区对无毒区应保持相对负压，防止病毒对培养细胞(尤其是细胞库)的污染。

B. 菌袋培养基补水注意啥

在食用菌栽培中,水分起着为菌丝和菇体提供营养的作用,是决定产量高低和快速转潮的重要因素。大多数品种的培养料适宜含水量为60%-65%,在出菇过程中培养料和空间的水分都逐渐减少,需要及时补充。在对菌袋的培养基补水时应当注意以下几个要点:
1.补水时机和补水量:香菇等转色完成、出菇前就要补水,补到培养料含水量65%左右。多数食用菌在第一潮菇采收后,基质营养丰富,基质中水分含量还较高,补水量宜少些;当长过第二潮菇后,基质营养减少,基质中的水分也降低,补水量可多些,菌袋浸水的时间可长些。补水时要先养菌,再补水,补水量控制在原菌袋重量的80%-90%为好。菌丝稀疏、长势弱、温度低于5℃或料内发生病虫害时不宜补水。三潮菇后补水时,可同时补充营养物质,常用尿素、糖、磷酸二氢钾等。
2.补水时应用清洁干净的河水或地下水:不宜使用地表的塘水和沟水,防止杂菌和害虫携带入基质中,引发病虫为害。
3.水温尽可能与菇棚温度一致,不要用冰凉的水:原基、菇蕾上不要喷水。最好用喷雾器补水,喷嘴朝上向空间喷雾增湿。
4.补水后:如菇体上有水珠应通风去除,否则会给病菌繁殖造成机会,在菇体上形成病斑。

C. 发酵培养基的要求配制培养基时应注意哪些问题

1. 明确培养基的配制原理。
2. 掌握配制培养基的一般方法和步骤。

学习细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物培养基的配制。

培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。
各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。培养细菌常用牛肉膏蛋白胨培养基，培养放线菌常用高氏I号培养基，培养霉菌常用蔡氏培养基或马铃薯培养基，培养酵母菌常用麦芽汁培养基或马铃薯葡萄糖培养基。另外还有固体、液体、加富、选择、鉴别等培养基之分。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。琼脂只是固体培养基的支持物，一般不为微生物所利用。它在96℃以上熔化成液体，而在45℃左右开始凝固成固体。在配制培养基时，根据各类微生物的特点，就可以配制出适合不同种类微生物生长发育所需要的培养基。
培养基除了满足微生物所必需营养物质外，还要求有一定的酸碱度和渗透压。霉菌和酵母菌的pH偏酸；细菌、放线菌的pH为微碱性。所以每次配制培养基时，都要将培养基的pH值调到一定的范围。
牛肉膏蛋白胨培养基配方
牛肉膏 3.0 g
蛋白胨 10.0g
NaCl 5.0g
水 1000mL
pH 7.4~7.6
高氏I号培养基配方
可溶性淀粉 20g
NaCl 0.5g
KNO3 1g
K2HPO4•3H2O 0.5g
MgSO4•7H2O 0.5g
FeSO4•7H2O 0.01g
琼脂 15—25g
水 1000mL
pH 7.4~7.6
马铃薯培养基配方
马铃薯（去皮） 200g
葡萄糖（或蔗糖） 20g
琼脂 15~25g
水 1000ml
自然pH
察氏培养基配方
蔗糖 30g
NaNO3 2g
K2HPO4 1g
KCl 0.5g
MgSO4•7H2O 0.5g
FeSO4•7H2O 0.01g
琼脂 15~25g
蒸馏水 1000ml
自然pH
实验器材
牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，1mol/LNaOH, 1mol/LHCl，KNO3，K2HPO4•3H2O，MgSO4•7H2O，FeS04•7H2O，马铃薯，蔗糖等。
试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，天平，牛角匙， pH试纸(pH 5.5~9.0)，棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。
实验步骤
1．牛肉膏蛋白胨培养基配制方法
(1) 称量：按培养基配方比例依次推确地称取牛肉膏、蛋白胨、NaCL放人烧杯中。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯，也可按在称量纸上，称量后直接放入水中，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称量纸分离，然后立即取出纸片。
蛋白胨很易吸湿，在称取时动作要迅速。另外，称药品时严防药品混杂，一把牛角匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再称取另一药品。瓶盖也不要盖错。
(2) 溶化：在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
在琼脂溶化过程中，应控制火力，以免培养基因沸腾而溢出容器。同时．需不断搅拌．以防琼脂糊底烧焦。配制培养基时，不可用铜或铁锅加热溶化，以免离子进入培养基中，影晌细菌生长。
(3) 调pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH,边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用mol/LHCL进行调节。
对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。
pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。因此，应将培养基的成分和琼脂分开灭菌后再混合，或在中性pH条件下灭菌，再调整PH。
(4) 过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。
(5) 分装
按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内。
1) 液体分装：分装高度以试管高度的l／4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
2) 固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
3) 半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。

图1-1 培养基的分装
A 漏斗分装装置 ；B 自动分装装置
1 铁架 ；2 漏斗 ；3孔胶管 ；4弹簧夹 ；5玻璃 ；6流速调节 ；7 装量调节 ；8开关
分装过程中，注意不要使培养基沾在管(瓶)口上，以免沾污棉塞而引起污染。
(6) 加塞

图1-2 棉塞的制作
培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或泡沫塑料塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。
(7) 包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
(8) 灭菌
将上述培养基以0.103MPa，121℃，20min高压蒸气灭菌。
(9) 搁置斜面
将灭菌的试管培养基冷至50℃左右〔以防斜面上冷凝水太多〕，将试管口端捆在玻棒或其他合适高度的器具上，搁置的斜面长度以不超过试管总长的一半为宜 。
(10) 无菌捡查
将灭菌培养基放人37℃的温室中培养24—48h，以检查灭菌是否彻底。
2．高氏I号培养基配制方法
(1) 称量和溶化
按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4•7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4•7H2O配成0.01g／ml，再在1000mL培养基中加1mL的0.0l g／m1的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
(2) pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
3．马铃薯培养基配制方法
取去皮马铃薯200g，切成小块，放入1500mL的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底。然后用双层纱布过滤，取滤液加糖（酵母菌用葡萄糖，霉菌用蔗糖），加热煮沸后加入琼脂，继续加热融化并补足失水。再按前所述，进行分装、加塞、包扎、0.1MPa灭菌20 min。
4．察氏培养基配制方法
方法同牛肉膏蛋白胨培养基配制。
实验结果及讨论
针对实验原理、步骤、现象进行讨论。
实验作业（选做3题）
1．牛肉膏应置于何种容器中称量为宜?
2．配制高氏合成一号培养基时，可溶性淀粉需经什么处理后才能倒入到沸水中?
3．何谓培养基的自然pH?
4．培养基配好后，为什么必须立即灭菌?如何检查灭菌后的培养基是无菌的
5．在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题?为什么?
6．配制合成培养基加入微量元素时最好用什么方法加入?天然培养基为什么不需要另加微量元素?
7．有人认为自然环境中微生物是生长在不按比例的基质中，为什么在配制培养基时要注意各种营养成分的比例?
8．你配制的高氏I号培养基有沉淀产生吗?说明产生或未产生的原因。
9．细菌能在高氏I号培养基上生长吗?为了分离放线菌，你认为应该采取什么措施?

D. 培养固体培养基的时候需要加入水吗还是只加琼脂

必培养自生固氮菌不需要氮源 因为固氮菌能固定空气中的氮素,对于生产用固体培养基是不需要加入琼脂的,它可以为其他生物提供氮源 A的错误在于,比如平菇的生产培养基培养基配方为42%玉米芯+20%棉籽壳+20%木屑+10%麦麸+5%稻糠+3%豆饼粉

E. 微生物培养基配制的最基本原则

1、选择适宜的营养物质

总体而言，所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源，但由于微生物营养类型复杂，不同微生物对营养物质的需求是不一样的，因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的元机物合成自身需要的糖类、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物，因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如，培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thiooxdans)的培养基组成见表3.9。在该培养基配制过程中并末专门加入其他碳源物质，而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌提供碳源。就微生物主要类型而言，有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分，培养它们所需的培养基各不相同。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基(或简称普通肉汤培养基)培养细菌，用高氏I号合成培养基培养放线菌，培养酵母菌一般用麦芽汁培养基，培养霉菌则一般用查氏合成培养基。
2、营养物质浓度及配比合适

培养基中营养物质浓度合适时微生物才能生长良好，营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需，浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用，例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长，反而起到抑菌或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代谢产物的形成和积累，其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的物质的量比值，有时也指培养基中还原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中，培养基碳氮比为4/l时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少；当培养基碳氮比为3/l时，菌体繁殖受到抑制，谷氨酸产量则大量增加。再如，在抗
生素发酵生产过程中，可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成协调。
3、控制pH条件
培养基的pH必须控制在一定的范围内，以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代谢产物。各类微生物生长繁殖或产生代谢产物的最适pH条件各不相同，一般来讲，细菌与放线菌适于在pH7～7.5范围内生长，酵母菌和霉菌通常在pH4.5～6范围内生长。值得注意的是，在微生物生长繁殖和代谢过程中，由于营养物质被分解利用和代谢产物的形成与积累，会导致培养基pH发生变化，若不对培养基pH条件进行控制，往往导致微生物生长速度下降或(和)代谢产物产量下降。因此，为了维持培养基pH的相对恒定，通常在培养基中加入pH缓冲剂，常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如KH2PO4 和K2HPO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性，KH2PO4溶液呈酸性，两种物质的等量混合溶液的pH为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时，H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物，培养基pH不会过度降低；如果培养基中OH-浓度增加，OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物，培养基pH也不会过度升高。但KH2PO4 和K2HPO4缓冲系统只能在一定的pH范围(pH6.4～7.2)内起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸，上述缓冲系统就难以起到缓冲作用，此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进行调节，CaCO3难溶于水，不会使培养基pH过度升高，但它可以不断中和微生物产生的酸，同时释放出CO2，将培养基pH控制在一定范围内。在培养基中还存在一些天然的缓冲系统，如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质，也可起到缓冲剂的作用。
4、控制氧化还原电位(redoxpotential)
不同类型微生物生长对氧化还原电位(F)的要求不一样，一般好氧性微生物在F值为+0.1V以上时可正常生长，一般以+0.3一+0.4V为宜，厌氧性微生物只能在F值低于+0.1V条件下生长，兼性厌氧微生物在F值为+0.1V以上时进行好氧呼吸，在+0.1V以下时进行发酵。F值与氧分压和pH有关，也受某些微生物代谢产物的影响。在pH相对稳定的条件下，可通过增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压，或加入氧化剂，从而增加F值；在培养基中加入抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等还原性物质可降低F值。
5、原料来源的选择
在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成分，特别是在发酵工业中，培养基用量很大，利用低成本的原料更体现出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中，常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再如，工业上的甲烷发酵主要利用废水、废渣作原料，而在我国农村，已推广利用人畜粪便及禾草为原料发酵生产甲烷作为燃料。另外，大量的农副产品或制品，如鼓皮、米糠、玉米浆、酵母浸膏、酒糟、豆饼、花生饼、蛋白胨等都是常用的发酵工业原料。
6、灭菌处理
要获得微生物纯培养，必须避免杂菌污染，因此对所用器材及工作场所进行消毒与灭菌。对培养基而言，更是要进行严格的灭菌。对培养基一般采取高压蒸汽灭菌，一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃条件下维持15～30min可达到灭菌目的。在高压蒸汽灭菌过程中，长时间高温会使某些不耐热物质遭到破坏，如使糖类物质形成氨基糖、焦糖，因此含糖培养基常在0.56kg/ cm2，112.6℃15～30min进行灭菌，某些对糖类要求较高的培养基，可先将糖进行过滤除菌或间歇灭菌，再与其他已灭菌的成分混合；长时间高温还会引起磷酸盐、碳酸盐与某些阳离子(特别是钙、镁、铁离子)结合形成难溶性复合物而产生沉淀，因此，在配制用于观察和定量测定微生物生长状况的合成培养基时，常需在培养基中加入少量螯合剂，避免培养基中产生沉淀，常用的螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)。还可以将含钙、镁、铁等离子的成分与磷酸盐、碳酸盐分别进行灭菌，然后再混合，避免形成沉淀；高压蒸汽灭菌后，培养基pH会发生改变(一般使pH降低)，可根据所培养微生物的要求，在培养基灭菌前后加以调整。在配制培养基过程中，泡沫的存在对灭菌处理极不利，因为泡沫中的空气形成隔热层，使泡沫中微生物难以被杀死。因而有时需要在培养基中加入消泡沫剂以减少泡沫的产生

F. 配制培养基的基本步骤有哪些应注意什么问题

按配方计算培养基中各种成分的用量→称量，（一般动作要迅速一些，因为其中可能有些成分容易吸潮）→溶化（将称好的各种成分溶解在水中，如果是固体培养基，需要使用凝固剂，如琼脂等，熔化时，注意搅拌，防止糊底）→调pH→灭菌（高压蒸汽灭菌）→倒平板

G. 配制培养基的步骤

培养基的配制：

1、配料：在容器中加入少量水，按照配方称取各种药品，加足所需水量（一药一勺，取药后立即盖上瓶盖）。

2、溶解：淀粉溶解：少量冷水调成糊状，加热溶解，特别是加有琼脂的培养基，一定要煮沸，琼脂的熔解温度95-97℃ ，且需要边加热边搅拌以防止烧焦。

3、调PH：用1N的盐酸或1N的 NaOH把培养基调节到所要求的值。

4、过滤：滤纸或棉花进行过滤。

5、分装：一般培养基放在三角瓶或试管中灭菌使用。

(1)三角瓶

若作静置培养，则100ml培养基/250ml的三角瓶，最多不能超过150ml培养基/250ml的三角瓶，否则灭菌时培养基沸腾容易污染棉塞，造成染菌；若作摇瓶培养，则15-20ml培养基/250ml的三角瓶，保证通气良好。

(2)试管分装

液体培养基一般装4-5ml，约试管的1/4高度。

固体斜面培养基一般装3-4ml，约试管的1/5高度。

6、包扎：分装好后，塞上棉塞，在用牛皮纸将棉塞包裹好，防止灭菌时水份进入把棉塞弄湿。

7、灭菌：按配方上要求的温度、压力进行高压蒸汽灭菌。如果灭菌的温度太高，营养成分会被破坏，培养基中的糖、氨基酸会使培养基的颜色变深。

8、摆斜面：灭菌后需要摆斜面的试管要趁热斜着摆放，使其凝固成为一个斜面，约占试管长度的1/2。

9、贮存：培养基在30℃下放置一天，无污染的即可使用。一般用牛皮纸包裹好存放于2-8℃冰箱中备用。

(7)培养基制作为什么要补水扩展阅读：

培养基，是指供给微生物、植物或动物生长繁殖的，由不同营养物质组合配制而成的营养基质。

一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐、维生素和水等几大类物质。培养基既是提供细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是细胞生长和繁殖的生存环境。

配置培养基注意问题：

1、 根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。

2、 注意各种营养物质的浓度及合适配比，保持合适渗透压 。

3、 将培养基的 pH 控制在适宜的范围之内，以利于不同类型微生物的生长繁殖或代谢产物的积累。

4、要注意各种原料的配比，每种培养基的配比合适的配比，可以按照老师的要求去做。

5、如需要加热的时候注意时间的把握。

参考资料：网络—培养基

H. 母种培养基如何制作

上述7个培养基配方中，马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）应用最普遍，在此着重介绍PDA培养基的配制方法。
（1）配制选择优质马铃薯，去皮，挖去发芽根，削去青皮切成薄片，称取200克，置于钢精锅或铝锅，加水1000毫升，煮沸后小火保持30分，用4层纱布过滤，取其汁液（上述配方中麸皮、米糠、玉米粉、黄豆粉、木屑等用同法取其汁液）。若滤液不足1000毫升，加水补足。然后加入琼脂继续加热，待琼脂完全溶化后，再加入葡萄糖，补水至1000毫升，用玻璃棒搅拌均匀，趁热分装试管或三角瓶中备用。（2）分装试管将配制好的PDA培养基，趁热到入事先准备好的分装器或漏斗、量杯，分装试管。每支试管培养基为管长的1/5～1/4，培养基液不可黏附管口内壁，如有黏附物必须擦试干净，以防杂菌感染。（3）塞棉塞棉塞要紧贴管壁，松紧度以用手指提起棉塞而不脱掉为宜，光圆不起皱，插入管口的长度为棉塞总长的2/3。然后将塞好棉塞的试管绑扎成捆，管口棉塞处用牛皮纸包扎好，以防灭菌时棉塞受潮，引起杂菌感染。（4）灭菌将包扎成捆的试管，放入手提式高压灭菌锅内，在0.15兆帕压力下灭菌30分钟。使用手提式高压锅时必须按要求进行操作，特别要注意加水和熄火这两个技术环节，以防烧锅、水浸试管和试管破裂、冲塞等人为事故。（5）排成斜面将取出的试管冷却到50～60℃后，放到用木架或木条摆成一定角度的斜面上，使之凝成斜面，倾斜度以斜面达到管长的1/2为度。待完全凝固后，即成试管斜面培养基，供分离、培养母种用。（6）检验随机抽取3～5支试管，置于25～30℃下培养3天左右进行培管查杂。若所查试管培养基表面或内部均无任何变化，则表面灭菌效果好，可供接种培养用；若个别试管的斜面上有杂菌菌落，说明灭菌不彻底，要重新灭菌。这种检验不是每次灭菌时都要进行，一般在新购灭菌锅灭菌时或中途长时间未用和随机抽验时才进行这种检验的。

I. 制培养基时为什么要再次用热水定容

培养基一般都是先高压灭菌，高温会影响pH值……

J. 配制培养基的原则和方法是什么

培养基有很多种，你要配制哪一种呢？

你要查清楚，你要配的培养基的成分有那些，然后把要用的东西找到。在配制之前你要把装培养基的容器准备好，是用试管、平皿还是三角瓶。之后看要配的是固体培养基还是液体培养基，觉得是否放琼脂或明胶。之后找来一个大烧杯，依次把要放的物质放入，要是配的是固体培养基要把加入琼脂或明胶的培养基放在电炉上加热，待琼脂或明胶完全溶解后趁热迅速分装。之后把分装好的培养基封口，之后选择是干灭还是湿灭，等灭菌之后，配制培养基的工作就完成了。

培养基的配制与灭菌

1目的
1.1了解并掌握培养基的配制、分装方法
1.2掌握各种实验室灭菌方法及技术。
2原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
3材料
3.1器皿及材料
天平、称量纸、牛角匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、三角瓶、漏斗、分装架、移液管及移液管筒、培养皿及培养皿盒、玻璃棒、烧杯、试管架、铁丝筐、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、乳胶管、电炉、灭菌锅、干燥箱。
3.2药品试剂
蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、琼脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麦芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、薯仔汁、豆芽计、磷酸铵、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。
4流程
称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。
5步骤
5.1培养基的制备
5.1.1称量药品
根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
5.1.2溶解
用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
5.1.3调节pH
根据培养基对pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液调至所需pH。测定pH可用pH试纸或酸度计等。
5.1.4溶化琼脂
固体或半固体培养基须加入一定量琼脂。琼脂加入后，置电炉上一面搅拌一面加热，直至琼脂完全融化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5.1.5过滤分装
先将过滤装置安装好（图3-1）。如果是液体培养基，玻璃漏斗中放一层滤纸，如果是固体或半固体培养基，则需在漏斗中放多层纱布，或两层纱布夹一层薄薄的脱脂棉趁热进行过滤。过滤后立即进行分装。分装时注意不要使培养基沾染在管口或瓶口，以免浸湿棉塞， 引起污染。液体分装高度以试管高度的1/4左右为宜。固体分装装量为管高的1/5，半固体分装试管一般以试管高度的1/3为宜；分装三角瓶，其装量以不超过三角瓶容积的一半为宜。
5.1.6包扎标记
培养基分装后加好棉塞或试管帽，再包上一层防潮纸，用棉绳系好。在包装纸上标明培养基名称，制备组别和姓名、日期等。
5.1.7灭菌
上述培养基应按培养基配方中规定的条件及时进行灭菌。普通培养基为121℃20min，以保证灭菌效果和不损伤培养基的有效成份。培养基经灭菌后，如需要作斜面固体培养基，则灭菌后立即摆放成斜面(图3-2)，斜面长度一般以不超过试管长度的1/2为宜；半固体培养基灭菌后，垂直冷凝成半固体深层琼脂。
5.1.8倒平板
将需倒平板的培养基，于水浴锅中冷却到45～50℃,立刻倒平板。
5.2灭菌方法
灭菌是指杀死或消灭一定环境中的所有微生物，灭菌的方法分物理和化学灭菌法两大类。本实验主要介绍物理方法的一种，即加热灭菌。
加热灭菌包括湿热和干热灭菌两种。通过加热使菌体内蛋白质凝固变性，从而达到杀菌目的。蛋白质的凝固变性与其自身含水量有关，含水量越高，其凝固所需要的温度越低。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。
5.2.1.高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌（图3-4）。
5.2.1.1操作方法和注意事项如下
加水
打开灭菌锅盖，向锅内加水到水位线。立式消毒锅最好用已煮开过的水，以便减少水垢在锅内的积存。注意水要加够，防止灭菌过程中干锅。
装料、加盖
灭菌材料放好后，关闭灭菌器盖，采用对角式均匀拧紧锅盖上的螺旋，使蒸汽锅密闭，勿使漏气。
排气

打开排气口(也叫放气阀)。用电炉加热，待水煮沸后，水蒸气和空气一起从排气孔排出，当有大量蒸汽排出时，维持5min，使锅内冷空气完全排净。
升压、保压和降压
当锅内冷空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。当压力上升至所需压力时，控制电压以维持恒温，并开始计算灭菌时间，待时间达到要求（一般培养基和器皿灭菌控制在121℃，20min）后，停止加热，待压力降至接近“0”时，打开放气阀。注意不能过早过急地排气，否则会由于瓶内压力下降的速度比锅内慢而造成瓶内液体冲出容器之外。
灭菌后的培养基空白培养
灭菌后的培养基放于37℃培养箱中培养，经24h培养无菌生长，可保存备用；斜面培养基取出后，立即摆成斜面后空白培养；半固体的培养基垂直放置凝成半固体深层琼脂后，空白培养。
5.2.2干热灭菌法
通过使用干热空气杀灭微生物的方法叫干热灭菌。一般是把待灭菌的物品包装就绪后，放入电烘箱中烘烤，即加热至160～170℃维持1～2h。
干热灭菌法常用于空玻璃器皿、金属器具的灭菌。凡带有胶皮的物品，液体及固体培养基等都不能用此法灭菌。
5.2.2.1灭菌前的准备
玻璃器皿等在灭菌前必须经正确包裹和加塞，以保证玻璃器皿于灭菌后不被外界杂菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用纸包扎或装在金属平皿筒内；三角瓶在棉塞与瓶口外再包以厚纸，用棉绳以活结扎紧，以防灭菌后瓶口被外部杂菌所污染；吸管以拉直的曲别针一端放在棉花的中心，轻轻捅入管口，松紧必须适中，管口外露的棉花纤维统一通过火焰烧去，灭菌时将吸管装入金属管筒内进行灭菌，也可用纸条斜着从吸管尖端包起，逐步向上卷，头端的纸卷捏扁并拧几下，再将包好的吸管集中灭菌。
5.2.2.2干燥箱灭菌
将包扎好的物品放入干燥烘箱内，注意不要摆放太密，以免妨碍空气流通；不得使器皿与烘箱的内层底板直接接触。将烘箱的温度升至160～170℃并恒温1～2h，注意勿使温度过高，超过170℃，器皿外包裹的纸张、棉花会被烤焦燃烧。如果是为了烤干玻璃器皿，温度为120℃持续30分钟即可。温度降至60～70℃时方可打开箱门，取出物品，否则玻璃器皿会因骤冷而爆裂。
用此法灭菌时，绝不能用油、蜡纸包扎物品。
5.2.2.3火焰灭菌
直接用火焰灼烧灭菌，迅速彻底。对于接种环，接种针或其它金属用具，可直接在酒精灯火焰上烧至红热进行灭菌。此外，在接种过程中，试管或三角瓶口，也采用通过火焰而达到灭菌的目的。
6结果
6.1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件（温度、压力等）。
6.2试述高压蒸汽灭菌的过程及注意事项。
7思考
7.1制备培养基的一般程序是什么？
7.2做过本次实验后，你认为在制备培养基时要注意些什么问题？
7.3灭菌在微生物学实验操作中有何重要意义？
4试述高压蒸汽灭菌的操作方法和原理。
5高压蒸汽灭菌时应注意哪些事项？