甘露醇海藻糖保藏菌种是控制什么
⑴ 保藏菌种的方法
一、菌种保藏
（一）、菌种保藏的目的
微生物在使用和传代过程中容易发生污染、变异甚至死亡，因而常常造成菌种的衰退，并有可能使优良菌种丢失。菌种保藏的重要意义就在于尽可能保持其原有性状和活力的稳定，确保菌种不死亡、不变异、不被污染，以达到便于研究、交换和使用等诸方面的需要。
（二）、菌种保藏的原理
无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。
（三）、菌种保藏的方法
1、斜面低温保藏法
将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏，如此连续不断。此法广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌等大多数微生物菌种的短期保藏及不宜用冷冻干燥保藏的菌种。放线菌、霉菌和有芽孢的细菌一般可保存6个月左右，无芽孢的细菌可保存1个月左右，酵母菌可保存3个月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蜡封口，置于4℃冰箱中保藏，不仅能防止水分挥发、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。这一改进可使菌种的保藏期延长。
该法的优点是简便易行，容易推广，存活率高，故科研和生产上对经常使用的菌种大多采用这种保藏方法。其缺点是菌株仍有一定程度的代谢活动能力，保藏期短，传代次数多，菌种较容易发生变异和被污染。
2、石蜡油封藏法
此法是在无菌条件下，将灭过菌并已蒸发掉水分的液体石蜡倒入培养成熟的菌种斜面（或半固体穿刺培养物）上，石蜡油层高出斜面顶端lcm，使培养物与空气隔绝，加胶塞并用固体石蜡封口后，垂直放在室温或4℃冰箱内保藏。使用的液体石蜡要求优质无毒，化学纯规格，其灭菌条件是：150～170℃烘箱内灭菌lh；或121℃高压蒸汽灭菌60～80min，再置于80℃的烘箱内烘干除去水分。
由于液体石蜡阻隔了空气，使菌体处于缺氧状态下，而且又防止了水分挥发，使培养物不会干裂，因而能使保藏期达1～2年，或更长。这种方法操作简单，它适于保藏霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等，对霉菌和酵母菌的保藏效果较好，可保存几年，甚至长达10年。但对很多厌氧性细菌的保藏效果较差，尤其不适用于某些能分解烃类的菌种。
3、砂土管保藏法
这是一种常用的长期保藏菌种的方法，适用于产孢子的放线菌、霉菌及形成芽孢的细菌，对于一些对干燥敏感的细菌如奈氏球菌、弧菌和假单胞杆菌及酵母则不适用。
其制作方法是，先将砂与土分别洗净、烘干、过筛(一般砂用60目筛，土用120目筛)，按砂与土的比例为(1～2)：1混匀，分装于小试管中，砂土的高度约1cm，以121℃蒸汽灭菌1～1.5h，间歇灭菌3次。50℃烘干后经检查无误后备用。也有只用砂或土作载体进行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培养基充分培养，再以无菌水制成108～1010个/ml菌悬液或孢子悬液滴入砂土管中，放线菌和霉菌也可直接刮下孢子与载体混匀，而后置于干燥器中抽真空约2～4h，用火焰熔封管口(或用石蜡封口)，置于干燥器中，在室温或4℃冰箱内保藏，后者效果更好。
砂土管法兼具低温、干燥、隔氧和无营养物等诸条件，故保藏期较长、效果较好，且微生物移接方便，经济简便。它比石蜡油封藏法的保藏期长，约1～10年。中国科学院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放线菌。
4、麸皮保藏法
麸皮保藏法亦称曲法保藏。即以麸皮作载体，吸附接入的孢子，然后在低温干燥条件下保存。其制作方法是按照不同菌种对水分要求的不同将麸皮与水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌匀，装量为试管体积2/5，湿热灭菌后经冷却，接入新鲜培养的菌种，适温培养至孢子长成。将试管置于盛有氯化钙等干燥剂的干燥器中，于室温下干燥数日后移入低温下保藏；干燥后也可将试管用火焰熔封，再保藏，则效果更好。
此法适用于产孢子的霉菌和某些放线菌，保藏期在1年以上。因操作简单，经济实惠，工厂较多采用。中国科学院微生物研究所采用麸皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可达数年至数十年。
5、冷冻真空干燥保藏法
冷冻真空干燥保藏法又称冷冻干燥保藏法，简称冻干法。它通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结，并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造成无氧真空环境，最后置于低温下，使微生物处于休眠状态，而得以长期保藏。常用的保护剂有脱脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物质。
由于此法同时具备低温、干燥、缺氧的菌种保藏条件，因此保藏期长，一般达5～15年，存活率高，变异率低，是目前被广泛采用的一种较理想的保藏方法。除不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其他大多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用这种保藏方法。但该法操作比较烦琐，技术要求较高，且需要冻干机等设备。
保藏菌种需用时，可在无菌环境下开启安瓿管，将无菌的培养基注入安瓿管中，固体菌块溶解后，摇匀复水，然后将其接种于适宜该菌种生长的斜面上适温培养即可。
6、液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏法简称液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水凝结成冰晶而使细胞损伤。美国ATCC菌种保藏中心采用该法时，把菌悬液或带菌丝的琼脂块经控制致冷速度，以每分钟下降1℃/min 的速度从0℃直降到-35℃，然后保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降温速度过快，由于细胞内自由水来不及渗出胞外，形成冰晶就会损伤细胞。据研究认为降温的速度控制在(1～10)℃/min，细胞死亡率低；随着速度加快，死亡率则相应提高。
液氮低温保藏的保护剂，一般是选择甘油、二甲基亚砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊环、吐温80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要选择不同的保护剂，再通过试验加以确定保护剂的浓度，原则上是控制在不足以造成微生物致死的浓度。
此法操作简便、高效、保藏期一般可达到15年以上，是目前被公认的最有效的菌种长期保藏技术之一。除了少数对低温损伤敏感的微生物外，该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体等都能用此法获得有效的保藏。此法的另一大优点是可使用各种培养形式的微生物进行保藏，无论是孢子或菌体、液体培养物或固体培养物均可采用该保藏法。其缺点是需购置超低温液氮设备，且液氮消耗较多，操作费用较高。
要使用菌种时，从液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃温水中，使之冰冻熔化，以无菌操作打开安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一种培养基斜面上进行培养。从液氮罐中取出安瓿瓶时速度要快，一般不超过1min，以防其他安瓿瓶升温而影响保藏质量。并且取样时一定要戴专用手套以防止意外爆炸和冻伤。
（四）、目前国内外主要菌种保藏机构
表8－1 国内主要菌种保藏机构
单位简称 单 位 名 称 单位简称 单 位 名 称
CCCCM 中国微生物菌种保藏管理委员会 NICPBP 卫生部药品生物制品检定所
CGMCC 中国普通微生物菌种保藏中心 － 中国预防医学科学院病毒研究所
AS 中国科学院微生物研究所 CACC 中国抗生素微生物菌种保藏中心
AS-IV 中国科学院武汉病毒研究所 IEM 中国医学科学院医学生物学研究所
ACCC 中国农业微生物菌种保藏中心 SIA 四川抗生素研究所
ISF 中国农业科学院土壤与肥料研究所 IANP 石家庄华北制药厂抗生素研究所
CICC 中国工业微生物菌种保藏中心 CVCC 中国兽医微生物菌种保藏中心
IFFI 中国食品发酵工业研究院 NCIVBP 农业部兽药监察研究所
CMCC 中国医学微生物菌种保藏中心 CFCC 中国林业微生物菌种保藏中心
ID 中国医学科学院皮肤病研究所 RIF 中国林业科学院林业研究所
表8－2 国外部分菌种保藏机构
单位简称 单位名称 单位简称 单位名称
ATCC 美国典型培养物收藏中心 NCTC 国家典型菌种保藏中心（英国）
NRRL 北方开发利用研究部（美国） IAM 东京大学应用微生物研究所(日本)
CBS 霉菌中心保藏所（荷兰） CCTM 法国典型微生物保藏中心
NCIB 英国国立工业细菌菌库 CMI 英联邦真菌研究所
IFO 大阪发酵研究所（日本） SSI 国立血清研究所
ATCC 美国典型培养物收藏中心 WHO 世界卫生组织
⑵ 母种的保藏方法有哪些
母种保藏的方法有很多种，具体采用哪种方法应根据实际情况而定。常用的基础方法有：斜面继代低温保藏、自然基质保藏（麦谷粒保藏、发酵粪草保藏、木屑保藏、麦麸+木片保藏、木块+琼脂保藏、稻草粉保藏草菇菌种、枝条保藏）、液体保藏[矿油保藏、菌丝球生理盐水保藏、蒸馏水保藏、营养液保藏、液氮保藏（图2-12）]、孢子滤纸保藏、真空冷冻干燥保藏、液氮超低温保藏、孢子沙土管保藏、梭氏真空干燥保藏等方法。专门保藏菌种的机构为确保保藏效果，每一品种都要同时用至少三种方法保藏，即长期方法、中长期方法和短期方法。限于篇幅，不再一一介绍。下面仅针对菇农介绍常用的低温和基质保藏法及几种土法保藏方法。
图2-12 母种的液氮保藏法
（1）斜面继代低温保藏
这是一种传统的、普遍应用的简易保藏方法，它简单易行，不需特殊设备，并能随时观察所保藏菌种的情况。其缺点是转管频繁，营养生长过多，易发生退化，在操作中发生技术错误的机会多；可能会因未及时转接、培养基干缩而引起菌种老化、死亡等。
这种方法是根据低温能抑制菌丝生长的原理，将需要保藏的菌种接种在斜面培养基上，适温培养，当菌丝健壮地快长满斜面时取出，放2～5℃低温干燥处或冰箱、冰柜中保藏。每隔一定时间要移植转管、继代培养1次（一般4～5个月），具体应根据菌种特性来确定。食用菌中有的中高温和高温型品种，不适于该法，如毛木耳多数品种保藏的适宜温度在10℃左右，中华灵芝在6～10℃，草菇在10～12℃。可在草菇菌落上灌注3～4毫升的防冻剂（10%的甘油）。
用于保藏的培养基，不宜用营养过贫或过富的合成培养基，一般采用天然培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、马铃薯综合培养基（CPDA）等。为防止产酸，糖应少加或不加，而需添加缓冲剂，如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、碳酸钙等，以中和菌种在保藏过程中产生积累的有机酸。同时，每1000毫升还需加 10毫克维生素 B1，加大琼脂用量至25克，以防止培养基中水分蒸发过快。如保藏香菇和黑木耳菌种，把配方中的葡萄糖更换成麦芽糖更有利。棉塞稍长，入管内达3厘米左右，制成半高层培养基，即斜面小、短，管底1.5厘米的培养基呈柱状。
橡皮塞密封保藏：选用与试管口相应大小的白橡皮塞，清洗、晒干，放入低压聚乙烯袋内，于0.137兆帕下灭菌1小时。在无菌条件下，将培养合格的斜面菌种用无菌橡皮塞取代原棉塞，置4～6℃冰箱内保藏，保藏时间可达6个月以上。这种方法能隔绝空气，防止蒸发，达到液体石蜡相似的效果。而且放置、邮寄、携带等很方便。
注意事项：
①保藏菌种必须是发育健旺的菌种，培养时间不可过长，以免降低菌种生活力。
②制种时要贴好标签，每次移接时要细心核对菌种号及标明时间，做到准确无误，若发现错误，应立即纠正，无法确认的，剔除不要。
③定期检查保藏情况，一旦发现污染或培养基失水干缩现象，应立即移接、剔除。
④尽量少启用冰箱，以免产生冷凝水而引起污染，开启时应做到边开、边取、边关，最好设置一个永久性的保藏冰箱，与常用菌种的冰箱分开。
⑤保藏菌种在冰箱中不可过分拥挤；保藏温度控制在3～5℃，不宜过高或过低。
⑥冰箱要定期排霜，清除积水。保藏时要注意环境湿度不能太高，湿度太高，霉菌容易在棉塞上生长，并通过棉花纤维进入管内。所以，最好用橡皮塞或硅氧海绵塞代替。若用棉塞，可用干净的纸（硫酸纸、牛皮纸均可）包扎好，也能起到减少污染、延缓培养基干缩的作用。
⑦所保存的菌种在使用时，要提前12～24小时从冰箱取出，经适温培养恢复活力后，方能转管移接。
（2）自然基质保藏
即利用食用菌自然生长的培养基来保藏菌种的方法。常用的有麦粒、谷粒培养基、发酵粪草、木屑木片、麦麸米糠等基质。
①麦（谷）粒保藏 此法利用麦粒、谷粒或玉米粒（碾碎）等作为培养基，进入颗粒的菌丝体，在表皮的保护和谷粒中有限水分的供给下，保藏期可达1～2年。现以麦粒为例介绍如下：
先将麦粒洗净，用20℃左右温水浸泡5小时后捞出晾干表面的水分（或置水中煮沸5分钟至不破皮），装入试管长度的2/3～3/4，塞好棉塞，置于1.18×105帕压力下灭菌30分钟。处理后麦粒的含水量不要超过25%，灭菌过程中勿使表皮破裂，以保护进入麦粒的菌丝体。灭菌后趁热摇散麦粒，冷却后，接种孢子液或菌丝悬浮液或菌丝块，然后置25℃下培养，当试管快发满菌丝后，即停止培养，保藏在干燥冷凉处。
②木屑保藏 用阔叶树木屑、麦麸加糖和石膏各1%，混合拌匀，加适量水后，装入试管长度的2/3，稍压紧，洗净管口，塞上棉塞，用纸包好，置1.18×105帕压力下灭菌40分钟，冷却后接种，置25℃条件下培养，菌丝长满后将棉塞蜡封或换橡皮塞，再包扎塑料袋置4℃冰箱中可保藏1～2年。
（3）井底低温保藏
即利用井底具恒温且温度低的原理进行菌种保藏的方法，适用于不具备保鲜冰箱的菇农。将要保藏的试管母种，用无菌橡皮塞醮石蜡封口，装入密闭的广口瓶或塑料袋中，扎紧，沉入井底贮藏，可保藏2～5个月。
（4）石蜡封口保藏
把蜡纸裁成6～8厘米见方，放75%酒精中浸泡1分钟。将已培养好试管种的管口在酒精灯火焰上方旋转灭菌后，用镊子取出蜡纸，扎紧管口。再将包好蜡纸的管口浸入熔化的石蜡中，将蜡纸完全浸入为止，使蜡纸紧紧封包在管壁上，绝不漏气。待石蜡冷却凝固后，置冰箱或室温下保存。
（5）玻璃纸封口保藏
用明胶15克（粘合剂），硫酸铜2克，美蓝1～2滴（指示剂），溶于100毫升热水中，配制成封口剂。将新长满的母种拔去棉塞，管口朝下，蘸上封口剂，贴上用95%酒精浸泡过的玻璃纸（赛珞璐），再用石蜡熔封。在室温下，菌种至少可保存8个月，并能防止霉菌或螨的侵染。在斜面注入无菌矿油（液体石蜡），可大大延长保藏时间。
（6）厩肥保藏
此法适合保藏双孢菇等草腐菌类。将腐熟牛粪等堆肥晒干、打碎，取300克干堆肥，用5毫米孔径筛过筛，加1000毫升水调湿，装入试管，占管深1/3～1/2，在0.15兆帕压力下灭菌2小时。确认无菌后，接种，菌丝长满后，放在3℃冰箱内保藏，每隔2年移植一次。在长期保藏中，如培养基失水，应将保藏菌种及时接种在琼脂斜面上进行活化，再继续保存。此法连续保藏4年后，其生产性状未出现明显变化。
⑶ 中国医学微生物菌种保藏管理办法
第一条组织及任务
在卫生部领导下，在中国微生物菌种保藏委员会指导下，设下列医学微生物菌种保藏管理中心：
中国医学真菌菌种保藏管理中心：由中国医学科学院皮肤病防治研究所负责。
中国医学细菌菌种保藏管理中心：由卫生部药品生物制品检定所负责。
中国医学病毒菌种保藏管理中心：由中国预防医学中心病毒学研究所负责。
保藏管理中心的任务是：
（一）负责本门类微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；
（二）开展菌种分类、鉴定及保藏管理的研究；
（三）组织学术交流和经验交流；
（四）办理国内外菌种交换；
（五）编制保管的菌种目录。
保藏管理中心下设专业实验室，承担全国性的业务工作。专业实验室对其直接领导机构和保藏管理中心负责，并定期向管理中心汇报工作情况。其具体任务是：
（一）负责本专业有关微生物菌种的选择、收集、鉴定、保藏、交换和供应；
（二）承担本专业有关疑难菌种鉴定；
（三）开展有关菌种分类、鉴定、保藏的研究，包括新技术、新方法的研究和应用；
（四）办理对外交流和交换菌种。
各专业实验室科研技术人员的编制和经费由所属主管部门负责。
生物制品生产、检定用的菌种按“生物制品生产、检定用菌种、毒种管理规程”执行，统一由卫生部药品生物制品检定所办理。第二条菌种的分类
菌种的分类根据其危险性决定（包括实验室感染的可能性，感染后发病的可能性，症状轻重及愈后情况，有无致命危险及有效的防止实验室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止实验室感染、我国有否此种菌种及曾否引起流行、人群免疫力等情况）。依其危险程度的大小，我国的菌种分为四类。
一类：实验室感染的机会多，感染后发病的可能性大，症状重并能危及生命，缺乏有效的预防方法，以及传染性强，对人群危害性大的烈性传染病，包括国内未发现或虽已发现，但无有效防治方法的烈性传染病菌种。如：
鼠疫耶尔森氏菌、霍乱弧菌（包括EL－tor弧菌）；
天花病毒、黄热病毒（野毒株）、新疆出血热（克里米亚刚果出血热）病毒、东、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、拉沙热（Lassa）病毒、马堡（Marburg）病毒、埃波拉（Ebola）病毒、猴疱疹病毒（猴B病毒）；
粗球孢子菌、荚膜组织胞浆菌、杜波氏组织胞浆菌。
二类：实验室感染机会较多、感染后的症状较重及危及生命，发病后不易治疗及对人群危害较大的传染病菌种。如：
土拉弗郎西丝氏菌、布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、鼻疽假单胞菌、类鼻疽假单胞菌、麻风分枝杆菌、结核分枝杆菌；
狂犬病病毒（街毒）、森林脑炎病毒、流行性出血热病毒、国内尚未发现病人在国外引起脑脊髓炎及出血热的其它虫媒病毒、登革热病毒、甲、乙型肝炎病毒；
各种立克次体（包括斑疹伤寒、Q热）；
鹦鹉热、鸟疫衣原体、淋巴肉芽肿衣原体；
马纳青霉、北美芽生菌、副球孢子菌、新型隐球菌、巴西芽生菌、烟曲霉、着色霉菌。
三类：仅具有一般危险性，能引起实验室感染的机会较少，一般的微生物学实验室采用一般实验技术能控制感染或有对之有效的免疫预防方法的菌种。如：
脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎双球菌、葡萄状球菌、链球菌、淋病奈瑟氏菌及其它致病性奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌、白喉棒杆菌及其它致病性棒杆菌、流感嗜血杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、致病性大肠埃希氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、空肠弯曲菌、酵米面黄杆菌、副溶血性弧菌、变形杆菌、李斯特氏菌、铜绿色假单孢菌、气肿疽梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌及其它致病梭菌；
钩端螺旋体、梅毒螺旋体、雅司螺旋体；
乙型脑炎病毒、脑心肌炎病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒以及未列入一、二类的其它虫媒病毒、新必斯（Sindbis）病毒、滤泡性口炎病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、柯萨奇（A及B组）病毒，艾柯（ECHO）病毒及其它肠道病毒、疱疹类病毒（包括单纯疱疹、巨细胞、EB病毒水痘病毒）、狂犬病固定毒、风疹病毒；
致病性支原体；
黄曲霉、杂色曲霉、梨孢镰刀菌、蛙类霉菌、放线菌属、奴卡氏菌属、石膏样毛癣菌（粉型）、孢子丝菌。
四类：生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种及不属于上述一、二、三类的各种低致病性的微生物菌种。
对通过分子生物学方法产生的新菌株，应按其原始亲本中的最高类别对待。
不允许进行两个菌株完整基因组的重组试验。
⑷ 防止菌种衰退的措施有哪些
（1）讲究配料用于制作原种、栽培种的培养料其原料要新鲜；难吸水的培养料应先用足够的水拌湿，充分拌匀后及时装瓶（袋），上锅灭菌，搁置时间不宜超过5小时。（2）细心装料根据培养料性质、培养时间、灭菌方法等，选用合适的瓶或袋。培养料装至离棉塞2～3厘米处，抹净瓶（袋）口，然后加棉塞，以免水分和培养料把棉塞玷污。制作母种注入培养基时要细心，切勿将培养基沾在试管口上。管口棉塞要松紧适中，过松易进杂菌。（3）灭菌彻底在灭菌时试管要轻放，瓶（袋）摆放要留空隙，棉塞不能互相挤压。根据培养料和容器装置，确定灭菌蒸汽压力（或温度）及灭菌时间。注意排出冷空气。放气速度要慢。（4）无菌操作料袋灭菌后冷却至不烫手时再搬动，可减少袋壁破裂。接种器具要保持洁净，用前要消毒。每个环节都要严格按无菌操作规程进行。（5）精选良种选用无污染、菌丝生长健壮的适龄母种和原种。接种前认真检查，并且不要用表层菌种接种。接种最好破开瓶底，从下部接至离表面2～3厘米处；若从瓶口取种，应把上层2～3厘米厚的菌种挖掉，然后接种。（6）净化环境培养室要通风干燥，启用前要清扫、消毒。培养菌种期间，每天要适当通风。当空气相对湿度大于70%时，要开吸湿机、空调机或用生石灰、木炭等降低室内湿度。（7）定期检查接种后5～7天检查1次是否有污染。污染杂菌的要及时拣出处理，并且找出原因，加以防治。搬动菌种瓶（袋）要小心轻放。同时还要预防老鼠、蟑螂等为害和带入杂菌。
⑸ 叙述海藻提取物的定义、分类、功能及其对环境尤其是土壤的生态影响
海藻以60％～75％乙醇提取，除去大分子蛋白质、核酸。多糖以及脂质得到含氮的低分子物质如游离氨基酸、结合氨基酸、核着酸及其衍生物、生物碱、磺酸以及有机酸、无机盐等低分子物质一起被称之为海藻提取物。
由于海藻富含多种生命活性物质，如多糖、高不饱和脂肪酸，牛磺酸、类胡萝卜素、甾淳及海带氨酸等，无论是作为日常食物，还是提取活性物质作为药品，海藻对人类都有着极大的好处。
海藻自古以来就是药有植物。在明代李时珍编写的《本草纲目》中就已经列举了海藻的药用价值。人们日常生活中吃的紫菜，可治脚气和咽喉肿痛；海带可治大脖子病，这是民间流传已久的方法。通过现代高科技手段，将海藻中的生命活性物质提取出来，合成药物，为发展我国的传统医学提供了新的契机。海藻中的海藻多糖、多卤多萜物质都具有提高人体免疫力、抗癌、抗病毒的活性。海藻多糖可以与HIV（人获得性免疫缺陷病毒）结合，使其失活，从而抑制病毒的复制，防治爱滋病；海藻多糖还可以降低血管中导致动脉粥样硬化的脂质含量，以及治疗心脑血管疾病。螺旋藻中的β－胡萝卜素可以保护人的视力。从深海鱼油中提取的高不饱和脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）具有提高大脑智力以及增强人体免疫力的功效，而在海藻中也可以提取出这两种物质。因此，以海藻为原料，进行药品生产，可以大大降低生产成本，从而提高经济效益。
海藻的表面有一层极为湿润的黏液，主要是用于退潮后保护海藻表面，防止日晒过度而造成死亡。根据这个原理，人们对这层黏液进行了研究，发现它是一种多糖类物质，具有极好的延展性能，将它制成化妆品，具有保湿、防晒的功效。现在市场上销售的大宝SOD蜜中的主要物质是SOD，它的中文名称叫做超氧化物歧化酶，可以防止由于过度日晒造成的皮肤表面氧化因子的活化，在海藻中也能够提取出这种酶。
海藻不仅可以作为食品、药物，还可以用于农业生产。海藻中含有吲哚乙酸、植物生长激动素、海藻酚等有机物质，用于种植业中作为肥料可以起到抗旱、抗盐碱渗透、耐寒、杀菌和促生长作用。将海藻制成肥料，不仅可降低成本、提高经济效益，还可以去除农药残留物对人体造成危害。将海藻粉添加到饲料中，可以改善肉质、提高产量，并且能够提高成活率，这主要是因为海藻的风味独特，而且富含氨基酸和蛋白质。
海藻类肥料施用主要采用叶面喷施，市场产品大多稀释1000倍左右，每亩喷洒量稀释后约60kg，所需成本1--2元。试验表明海藻类肥料具有明显的促进生长效果，增产幅度达7．1％～26％。试验还证明海藻类肥料使用不仅可增加作物产量，且还可改善作物品质，改善土质环境．避免土壤板结等。同时还在抗寒、抗旱和抗病等方面显示出明显的抗逆效果。由于海藻是生长在海洋中的低等光合营养植物，是海洋有机物的原始生产者，它除含有陆地植物所具有营养成份外，还含有许多陆地植物不可比拟的碘、钾、镁、锰、钛等微量元素以及海藻多糖、甘露醇等，海藻中的特殊成份海藻多糖不仅能螫合重金属离子，且能增加土壤透气能力，同时海藻还含有种类繁多的维生索、含N化合物等，在农业上的应用，可减少化肥的使用量，有效改善生态环境。
⑹ 药用真菌的分离培养与菌种保藏是什么
（冉砚珠）
一、纯菌种的分离培养
为了得到某种药用真菌的纯菌种，必须将它从其周围的其他生物或微生物中分离出来。分离工作要根据药用真菌的特性，从分离方法、培养基的种类、培养条件的控制以及在培养基中是否添加某种抑制剂等等综合考虑，否则达不到分离菌种的有效目的。纯菌种的分离方法大致有三种：组织分离、孢子分离及寄主分离。
（一）组织分离法
利用幼嫩组织中的菌丝，在无菌条件下，接种在培养基上，重新恢复为没有组织分化的菌丝体，这种方法分离得到的菌种生命力强，菌丝生长快，得到纯菌的生活率较高。此法适应范围较广，特别是对有些孢子不易萌发或萌发速度不一致的种类以及菌核、菌索等组织，采用此法为宜。
进行组织分离，事先要对分离材料进行选择，要求材料必须是品系纯正，品质优良，幼嫩肥壮而无病虫害，然后进行表面消毒处理。先用清水洗净外面沾附的泥土或杂物，放入无菌操作室（柜）中的无菌器皿内，用表面消毒剂（如0.1—0.2%升汞、10%漂白粉、70—75%酒精、5%来苏儿或2%甲醛等）溶液浸泡一定时间。消毒时间要根据消毒剂的特性和菌体组织的质地、大小而定。一般如菇类（香菇、蜜环菌）鲜嫩的组织，消毒时间要短，控制在0.5—1.0分钟，这样既不会伤害组织又能达到组织表面杀菌的目的；像表皮组织比较厚的猪苓菌核，在5%的来苏儿溶液中泡半小时以上，不致影响生活力。升汞溶液杀菌力较强，组织经表面消毒后，必须再经无菌水冲洗，去掉附着的残留药物，以免影响菌体萌发生长。无菌水冲洗后要用灭菌滤纸吸去沾附的水分，用无菌刀将组织切割成约0.5cm2小块，分别放置在预先灭过菌而装有培养基的培养皿或试管中，一般每皿5块左右，排开保持一定间隔，试管内仅放1块为宜。培养时将皿底朝上，置24—28℃恒温下培养数天，组织块周围就可长出新的菌丝，再经纯化即可得到纯菌种。
表面消毒时，如方法掌握不当或无菌操作不严格，往往会造成污染，消毒过度则菌体本身生活力丧失而分离不出纯菌种，分离多孔菌类或菌肉较肥厚的伞菌类真菌，也可不用药剂浸泡，只要用70—75%酒精棉涂擦外皮后，去掉表皮，挑取内部组织块直接进行分离。为了防止细菌感染，可将要分离的组织小块用0.1—0.5%金霉素（或链霉素）浸蘸一下再移置。为防止培养基上污染细菌可在每毫升培养基内加入0.125mg氯霉素，因它较前两种稳定、耐高温，可与培养基一同高压灭菌。
分离药用真菌时，通常使用的培养基成分如下：
马铃薯（去皮） 200g（切碎煮沸半小时过滤去渣）
蔗糖 20g
磷酸二氢钾 3g
硫酸镁 1.5g
维生素B1 10mg
琼脂 18g（加水至1000ml）
除上述培养基外，也常用沙氏培养基或马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基。
（二）孢子分离法
这是利用药用真菌的菌褶或菌孔中着生的孢子，使其在无菌条件下弹射在适合生长的培养基上，并萌发生长成菌丝而得到纯菌种的一种方法。这种方法在香菇、银耳、茯苓等药用真菌中分离应用。
药用真菌的有性孢子，都是由异性的细胞核，经核配后形成的，具双亲的遗传性，变异性大，生命力强，适于育种工作采用，为防止杂菌感染，分离材料要严格消毒，对于子实层未外露的子实体，可浸入0.1—0.2%升汞溶液中2—3分钟进行表面消毒。子实层外露的如香菇，为避免孢子杀伤，需用70—75%酒精对菌盖、菌柄进行表面消毒，把子实体切去菌柄，插在金属丝制成的支架上，一并放入培养皿中，外面套以玻璃缸或钟形罩，经数小时后在培养皿内就可以收集到大量的孢子。此外也可以采取悬挂法。如银耳，将耳瓣用清水洗净后，放入无菌三角瓶或大试管内，以无菌水振荡冲洗三次，取出放于无菌玻皿内，用滤纸吸去多余水分，剪一片耳瓣在灭过菌的细铁丝钩上，然后悬挂在倒有一薄层培养基的三角瓶中，耳瓣距基面2—3cm。在24—26℃下，经1—2天培养，就可在基面上隐约可见到白色孢子。再继续培养2—3天就可以形成乳白色糊状突起菌落。即银耳芽孢菌种。由于这样得到的菌种在木屑上菌丝不能萌发，故不能直接作为瓶栽的菌种。
茯苓菌担孢子分离是在其子实体发射孢子云时采用。用空中捕捉法，以试管口对准孢子云，使孢子落入试管培养基上。或用附着法，即使上升的孢子云附着在培养基上面，在25℃下培养。
如果以杂交育种为目的，要采用单孢子分离法。利用单孢子分离器进行单孢子分离，是目前先进手段，但设备昂贵，国内只有少数单位使用。较为广泛应用的是菌液连续稀释法。其方法是用无菌水把孢子冲散，最大限度地降低孢子在无菌水中的分布密度，最后使每滴水中只含1—2个孢子。然后用无菌注射器吸入孢子悬浮液，滴在斜面基表面，转动试管，菌液便均匀分布在斜面上，经适温培养，选优良菌落进行纯化。异宗结合担子菌的单孢子分离物，虽然可繁殖菌丝，但不会形成子实体，故不能用于栽培生产。
（三）寄主分离法
此法也称基内菌丝分离法。这是利用生长某种药用真菌菌丝的基质做分离材料而获得纯菌种的一种方法。一般只有在上述两种方法不能达到目的的情况下应用。被选做种子的子实体，若孢子已释放完毕，子实体开始干枯或腐烂，菌丝失去活性，难以用孢子分离及组织分离法得到纯菌种，或某些品种子实体的质地为胶质（银耳、木耳）、革质（云芝）、木栓质（灵芝）、木质（针裂蹄）等类群均可采用此法。
选择菌木的标准：生长的子实体性状优良，基内菌丝发育旺盛，菌木未腐烂无杂菌污染。为防止细菌污染，除使用酸化培养基或加入抗菌素外，应使菌木风干失水。如耳木、菇木及苓木。以银耳为例，选好耳木后，在子实体生长的部位，削下1—1.5cm厚的菌木一片，去掉树皮，把菌木片放入0.1%升汞液中浸泡几分钟表面消毒，冲去药液，吸干表面水分，放入无菌室（柜）的培养皿内，切去木片外层，将中间生长菌丝的部分，用无菌刀切成0.5cm2大小小块，放入培养基表面进行适温下培养和纯化移植。
由于药用真菌种类不同，所形成的菌落外观及结构也各有差异。因此鉴定所分离的菌种，除根据经验外，更确切的是经过一段培养，待形成一些特殊结构，如菌丝束、菌核、菌索，尤其是子实体和孢子后方可判断。
二、菌种的保藏与复壮
药用真菌菌种是国家的重要资源与天然财富。也是药用真菌生产与科研的基础。药用真菌的“种”不同，其药用价值及培养条件也不同，就是同一“种”的不同菌株，也同样有差异。在生产实践中要选用符合生产要求的菌种，应具备药效好，生产周期短、产量高、生活力强等特点。对有效成分明确的，应选用含量高的菌株，对有效成分未确定的，应选药理作用显着，无毒性反应及临床疗效好，产量高的菌种。生产上也可以根据一定的目的要求，应用菌体的自然变异加以选择，不断巩固其特性育成新菌株或人为的定向培育改良菌种特性。如通过杂交或诱变育种选择优良菌株，使生产或有效物质含量达到新的水平。
一个品系纯正、品质优良的菌种，常由于管理不善和传代过多以及贮藏方法不当等原因，而引起优良性状的退化，这种现象称为菌种退化。为防止菌种性状的退化或恢复已经发生退化的菌种原有性状，应采取科学的保藏方法与有效的复壮措施。
（一）菌种的保藏方法
药用真菌菌种在干燥低温、冷冻或减少氧气含量等条件下保藏，使其代谢强度降低，维持菌种的休眠状态，就可防止菌种退化。
1.斜面低温保藏
除草菇等个别属高温型菌种，适于在15℃左右条件下保藏外，绝大多数种类都适合于低温保藏。即把保存的菌种放于4—5℃左右冰箱中，经3—6个月转管传代一次。为恢复菌种的生活能力，需在使用前1—2天从冰箱中取出，置于常温下进行活化转管，不能直接使用。
2.矿物油封藏法
将上述斜面菌种，灌注一层灭菌的液体石蜡油，在三角烧瓶中灭菌时由于有蒸汽进入，会影响所保存菌种的质量，因此需要放在40℃温箱中使水蒸气蒸发后再使用。冷石蜡油用无菌吸管注入，注入量要足够覆盖整个斜面并高出培养物1cm，试管口棉塞用玻璃纸或塑料布包紧，放置冰箱或室温保存。这种保存方法可以防止培养基失水及外界空气进入，可降低新陈代谢，保持菌种活力，从而起到延长菌种使用寿命的效果。从石蜡管中挑取菌丝移置到新斜面上活化培养，以后可供生产用。此法可保存菌种1—2年不丧失活力。
3.冷冻干燥法
此法是采用真空、干燥和低温三结合保藏菌种的方法，保存期可长达10—20年。具体方法：将保存真菌的孢子制成悬浮液，装入安瓶管中，然后骤然降温冷冻，并抽出空气成真空状态，使培养物以固体状态升华脱水，熔封瓶口后，在低温或室温下保存。
4.液氮超低温保藏法
超低温能使代谢机能降低到最低水平而菌种不发生变异。实验证明，采用这种新技术可以保藏所有的微生物菌种。液氮超低温冰箱内的温度可达-196—-130℃。超低温保藏菌种具高效、使用范围广、操作简便等优点，但仪器价格昂贵，应用尚不普遍。
除上述几种保藏菌种方法外，还发现灵芝菌（赤芝、薄盖灵芝）在麦麸及小米斜面上，于低温（4℃左右）保存一年多仍具有生命力。若保存管的棉塞换以橡皮塞则可保存达4年以上。
（二）菌种复壮
药用真菌的种类繁多，生物特性各异，任何一个选育出来的优良品种，都常因多次传代培养，长期进行人工培养或长期保藏而不进行转管以及保藏条件不适等，菌种就会发生自然变异，出现退化现象。
菌种退化的主要表现有，菌丝体生长缓慢，子实体性状变坏，产量下降以及有效成分降低等。过多次传代，会由于菌丝长期处在活跃的营养生长状况，生命繁衍受到抑制，因此传代次数应控制在2—3次之间。已经产生退化的菌种，有必要继续保留和应用时，则必须进行菌种复壮。进行菌种复壮时，除应改善培养条件外，对已驯化的栽培种类，最可靠的方法就是进行有性繁殖（孢子分离）。
银耳菌丝菌种，经多次传代后会出现生活力弱，出耳率低的退化现象。可利用加入芽孢的方法复壮菌种。即取芽孢试管1支注入10ml无菌水，将芽孢悬液接入锯木屑菌种中，这样菌种出耳率会得到提高。芽孢菌种在木屑基中不能萌发菌丝，如加上1—2%过磷酸钙和1—2%骨粉则可萌发菌丝。用重新接种原寄主的方法也可起复壮作用。
⑺ 菌种保藏应控制的条件
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1一般菌种都是厌氧型,所以不需要氧气
2培养基不能是干燥的
3空气中含其他细菌,会污染培养基
4菌种不进行光合作用,不需要光
5适当的低温,降低细菌代谢,有利于保藏
⑻ 常用的菌种保存方法有哪些
菌种保藏是食用菌产业的一项基础工作，是确保野生种质资源基因留存和现有生产用种遗传性能相对稳定的必要手段。菌种保藏的方法多种多样，有的虽然保藏效果好，但投资高或操作繁杂。在生产实践中，更需要设备投入少，能保障菌种不死亡、不污染、最大限度地保持优良种性的简便方法，如斜面低温短期保藏和自然基质较长期保藏相结合的方法。
一般而言，对母种进行长期保存，对原种进行短期保存。须保证优良菌种的性状和活力不发生变异，不死亡，不被污染，确保其纯度。因此，保存方法应具备取材容易、操作方便、菌种不易退化、长期保存不污染杂菌等优点。常用的菌种保存方法如下：
（一）斜面低温保藏 该法的优点是保藏方便且所占空间较小。具体做法是：菌丝长满斜面后，放在0～5℃保存。以后每隔一定时间（2～3个月）转管一次。转管保存不能长期用PDA培养基，否则种性易退化，灰树花降解木质纤维素的能力减弱。因此隔一定时间（1年左右）须把菌种转接到木屑培养基上复壮，之后挑选健壮无污染的菌丝再转回PDA培养基保存。在长期保存过程中，要防棉塞受潮滋生杂菌。菌种试管口最好用蜡烫封，以防培养基内水分过快蒸发。增加琼脂用量（2.5%～3%）可减缓水分蒸发。还要防止菌种管上的标签脱落而造成种系混杂。
斜面低温保藏方法简便易行，能随时观察保藏菌株的活力和纯度，一旦染杂，肉眼能及时发现。
（二）自然基质保藏 此法是根据灰树花的特性，利用自然基质保藏其菌种的方法。灰树花是木腐菌，可以采用以木屑为主料的培养基。自然基质营养全面，且大部为缓释养分，不易产生营养过剩或饥饿；其次，培养基理化性状好，可吸收或缓冲菌丝代谢出的有害物质，水分与通气协调平衡，部分菌丝扎入基质内生长，不裸露于空气中，菌丝呼吸强度低，生命力强。
1.原料与配方 粗、细木屑比例适当，采用板栗树木屑最佳，粗木屑粒径为2毫米左右，细木屑为一般圆盘锯屑，粗、细的比例为1∶2，添加干木屑重量20%的麸皮和1%的糖，含水率为60%左右。这样的基质通气性好，营养丰富且供菌丝分解利用的时间长，长到基质内部的菌丝比包裹在基质外部暴露于空气中的菌丝耐受性强。不同粒径的基质比例适当，还能协调气与水的矛盾。粗粒过多，架空菌丝多；细粒过多，透气性差，菌丝生长慢。应用配方如下：
栗木屑78%，麸皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，装入较粗大的试管中，装料量为试管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2灭菌1.5小时。冷却后，接入需保藏的菌种，在28℃下培养，待菌丝长满木屑培养基时取出换上无菌橡皮塞，在0～5℃冰箱内保藏1～2年转管一次。
2.容器与装量 采用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗洁净，装量一般不超过玻璃瓶容量的3/5，填料不能过满，瓶壁所残留的颗粒须擦拭干净，否则保藏的菌种易引起污染。
3.灭菌和冷藏 灭菌时若采用棉塞封口，基质表层易失水，接种成活率低，即使菌丝复活，生长也很缓慢，所以最好采用聚丙烯膜封口，接种后换用无菌棉塞培养，待菌丝长满后再换成有孔灭菌胶塞冰箱保藏。
用上述方法保藏的菌种经3年贮放后，接出成活率均达90%以上，出菇验证产量及子实体形态特征均无明显变化。因此，自然基质保藏法具有保存期长，菌种遗传性能相对稳定的特点。
（三）木粒PDA斜面保藏 灰树花在自然状态下易发生于栗树根部，这说明其营养需求较为特殊。根据灰树花这种习性，在PDA基础上添加适量的栗树木粒制成母种培养基。在多年的使用中发现，用该培养基培养的母种生长势好，在转接原种时，适应能力强，萌发定植快；用作菌种保藏基质时，保藏时间长，并能很好保持菌种的优良性状。
1.木粒PDA的制作 选取栗树边材，加工成0.3～0.5厘米的颗粒，及时烘干或晒干备用。称取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解于1升清水中配制成营养液。将营养液倒入盛有木粒的小铝锅中，营养液以完全浸没木粒为准。煮沸10分钟，以加快木粒对营养液的吸收速度，起锅静置30分钟让木粒吸足营养液。捞出木粒，沥掉表面的水，装入试管，装量为试管长的1/6，最多不得超过试管长的1/5，否则在摆制斜面时，不易使木粒均匀分散于斜面的表面上。
选取新鲜的马铃薯，去皮并切成薄片，称取200克放入小铝锅中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁热过滤取汁，并补足1升的体积。称取琼脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先将琼脂剪碎，加入到马铃薯滤液中，继续用文火加热，使琼脂溶化。待琼脂完全溶化后，加入称好的其他3种营养成分，搅拌使这些物质溶解均匀，趁热装入已装有木粒的试管中，装至试管长的1/3处，塞上棉塞。
在0.8～1千克/厘米2蒸气压下灭菌40分，待气压降至0时，开盖取出，趁热轻轻抖拍试管，使木粒分散后即可摆制斜面，并使木粒呈半裸状分布于斜面上，待凝固后便制成了木粒PDA培养基。
2.生长及保藏效果 木粒PDA斜面上培养的灰树花母种，菌丝生长迅速、良好，12天即可长满试管，但菌丝的后期生长势更为粗壮、浓密，后劲足。转接原种时，菌种适应力强，定植快。这表明，灰树花菌丝的生长速度、生长势不仅取决于本身的遗传性，而且很大程度上取决于培养基的营养。常规PDA的营养成分，主要是可溶性的速效性营养，前期营养丰富，营养利用直接，因而前期菌丝生长迅速、良好，后期营养则不足，菌丝生长不良，长势欠佳。木粒PDA由于在增添了木粒这一缓效性营养，就木腐性的灰树花而言，营养配伍合理，补充了菌丝生长后期所需的营养，因此后劲足。
菌丝体对基质的分解利用是通过菌丝细胞分泌的胞外酶，将基质中的大分子营养分解成小分子营养后才被吸收利用的，而这些胞外酶大多为诱导酶，其合成与分泌受基质的诱导和分解产物阻遏机制调节。就纤维素酶而论，许多易代谢碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同时伴随着菌丝体的旺盛生长，酶的大量合成则出现在易代谢碳源基本耗尽之后，且受到基质纤维素的诱导，常规PDA基质，到葡萄糖等易代谢碳源基本耗尽的后期，由于营养的缺乏，菌丝生理机能下降，酶的合成量减少。而木粒PDA不仅含有易代谢碳源——葡萄糖，又含有木粒这一缓效性营养，前期葡萄糖促进了菌丝体旺盛生长，获取了大量的菌丝体，表现为菌丝粗壮、浓密。到了易代谢碳源耗尽的后期，木粒一方面补充了后期所需的营养，使菌丝的生埋机能维持在一定的水平；另一方面木粒的纤维素激活菌丝细胞纤维素酶的诱导机制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰树花较强的分解木材的能力，因此，用该培养基培养的母种在转接原种时适应力强，萌发定植快。因部分菌丝长入木粒内部，抵抗不良环境的生存能力增强，种质不易退化。木粒PDA灰树花菌种，在0～5℃保藏2～3年再转管活化，成活率仍达到90%左右。此外，木粒PDA应用于木腐性灰树花种的提纯复壮，效果也较理想。
（四）石蜡隔氧封藏 具体做法是将液态石蜡分装入三角瓶内，装量达瓶空间的1/3，塞好棉塞，于121℃灭菌2小时，然后置40℃温箱中，使其水分蒸发，或置于干燥器内数日以除去水分，石蜡呈透明状为宜。在无菌条件下，用无菌吸管装入已长好菌丝的斜面试管，使液面高出斜面顶部1厘米左右。塞上无菌橡皮塞，竖直保存。此法可使菌种存活3年以上，但以1～2年移植一次为好。移植时不必倒出石蜡，用接种钩取一块菌丝即可。因转移时带有石蜡，菌丝生长弱，需要再转管1～2次，方能复壮。