甘露醇海藻糖保藏菌種是控制什麼
⑴ 保藏菌種的方法
一、菌種保藏
（一）、菌種保藏的目的
微生物在使用和傳代過程中容易發生污染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退，並有可能使優良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在於盡可能保持其原有性狀和活力的穩定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達到便於研究、交換和使用等諸方面的需要。
（二）、菌種保藏的原理
無論採用何種保藏方法，首先應該挑選典型菌種的優良純種來進行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應根據微生物生理、生化特點，人為地創造環境條件，使微生物長期處於代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態。這些人工造成的環境主要是乾燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養、添加保護劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。
（三）、菌種保藏的方法
1、斜面低溫保藏法
將菌種接種在適宜的斜面培養基上，待菌種生長完全後，置於4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉接至新的斜面培養基上，生長後繼續保藏，如此連續不斷。此法廣泛適用於細菌、放線菌、酵母菌和黴菌等大多數微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍乾燥保藏的菌種。放線菌、黴菌和有芽孢的細菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置於4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進可使菌種的保藏期延長。
該法的優點是簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產上對經常使用的菌種大多採用這種保藏方法。其缺點是菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數多，菌種較容易發生變異和被污染。
2、石蠟油封藏法
此法是在無菌條件下，將滅過菌並已蒸發掉水分的液體石蠟倒入培養成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養物與空氣隔絕，加膠塞並用固體石蠟封口後，垂直放在室溫或4℃冰箱內保藏。使用的液體石蠟要求優質無毒，化學純規格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置於80℃的烘箱內烘乾除去水分。
由於液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處於缺氧狀態下，而且又防止了水分揮發，使培養物不會乾裂，因而能使保藏期達1～2年，或更長。這種方法操作簡單，它適於保藏黴菌、酵母菌、放線菌、好氧性細菌等，對黴菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達10年。但對很多厭氧性細菌的保藏效果較差，尤其不適用於某些能分解烴類的菌種。
3、砂土管保藏法
這是一種常用的長期保藏菌種的方法，適用於產孢子的放線菌、黴菌及形成芽孢的細菌，對於一些對乾燥敏感的細菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。
其製作方法是，先將砂與土分別洗凈、烘乾、過篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)：1混勻，分裝於小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～1.5h，間歇滅菌3次。50℃烘乾後經檢查無誤後備用。也有隻用砂或土作載體進行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養基充分培養，再以無菌水製成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和黴菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而後置於乾燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置於乾燥器中，在室溫或4℃冰箱內保藏，後者效果更好。
砂土管法兼具低溫、乾燥、隔氧和無營養物等諸條件，故保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經濟簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。中國科學院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。
4、麩皮保藏法
麩皮保藏法亦稱曲法保藏。即以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然後在低溫乾燥條件下保存。其製作方法是按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：(0.8～1.5)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌後經冷卻，接入新鮮培養的菌種，適溫培養至孢子長成。將試管置於盛有氯化鈣等乾燥劑的乾燥器中，於室溫下乾燥數日後移入低溫下保藏；乾燥後也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。
此法適用於產孢子的黴菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。因操作簡單，經濟實惠，工廠較多採用。中國科學院微生物研究所採用麩皮保藏法保藏麴黴，如米麴黴、黑麴黴、泡盛麴黴等，其保藏期可達數年至數十年。
5、冷凍真空乾燥保藏法
冷凍真空乾燥保藏法又稱冷凍乾燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液於安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結，並減壓抽真空，使水升華將樣品脫水乾燥，形成完全乾燥的固體菌塊。並在真空條件下立即融封，造成無氧真空環境，最後置於低溫下，使微生物處於休眠狀態，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、澱粉、葡聚糖等高分子物質。
由於此法同時具備低溫、乾燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛採用的一種較理想的保藏方法。除不產孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可採用這種保藏方法。但該法操作比較煩瑣，技術要求較高，且需要凍干機等設備。
保藏菌種需用時，可在無菌環境下開啟安瓿管，將無菌的培養基注入安瓿管中，固體菌塊溶解後，搖勻復水，然後將其接種於適宜該菌種生長的斜面上適溫培養即可。
6、液氮超低溫保藏法
液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。它是以甘油、二甲基亞碸等作為保護劑，在液氮超低溫（-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌種細胞從常溫過渡到低溫，並在降到低溫之前，使細胞內的自由水通過細胞膜外滲出來，以免膜內因自由水凝結成冰晶而使細胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心採用該法時，把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經控制致冷速度，以每分鍾下降1℃/min 的速度從0℃直降到-35℃，然後保藏在-150℃～-196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由於細胞內自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細胞。據研究認為降溫的速度控制在(1～10)℃/min，細胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應提高。
液氮低溫保藏的保護劑，一般是選擇甘油、二甲基亞碸、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護劑，再通過試驗加以確定保護劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。
此法操作簡便、高效、保藏期一般可達到15年以上，是目前被公認的最有效的菌種長期保藏技術之一。除了少數對低溫損傷敏感的微生物外，該法適用於各種微生物菌種的保藏，甚至連藻類、原生動物、支原體等都能用此法獲得有效的保藏。此法的另一大優點是可使用各種培養形式的微生物進行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養物或固體培養物均可採用該保藏法。其缺點是需購置超低溫液氮設備，且液氮消耗較多，操作費用較高。
要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，並迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養基斜面上進行培養。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質量。並且取樣時一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。
（四）、目前國內外主要菌種保藏機構
表8－1 國內主要菌種保藏機構
單位簡稱 單 位 名 稱 單位簡稱 單 位 名 稱
CCCCM 中國微生物菌種保藏管理委員會 NICPBP 衛生部葯品生物製品檢定所
CGMCC 中國普通微生物菌種保藏中心 － 中國預防醫學科學院病毒研究所
AS 中國科學院微生物研究所 CACC 中國抗生素微生物菌種保藏中心
AS-IV 中國科學院武漢病毒研究所 IEM 中國醫學科學院醫學生物學研究所
ACCC 中國農業微生物菌種保藏中心 SIA 四川抗生素研究所
ISF 中國農業科學院土壤與肥料研究所 IANP 石家莊華北制葯廠抗生素研究所
CICC 中國工業微生物菌種保藏中心 CVCC 中國獸醫微生物菌種保藏中心
IFFI 中國食品發酵工業研究院 NCIVBP 農業部獸葯監察研究所
CMCC 中國醫學微生物菌種保藏中心 CFCC 中國林業微生物菌種保藏中心
ID 中國醫學科學院皮膚病研究所 RIF 中國林業科學院林業研究所
表8－2 國外部分菌種保藏機構
單位簡稱 單位名稱 單位簡稱 單位名稱
ATCC 美國典型培養物收藏中心 NCTC 國家典型菌種保藏中心（英國）
NRRL 北方開發利用研究部（美國） IAM 東京大學應用微生物研究所(日本)
CBS 黴菌中心保藏所（荷蘭） CCTM 法國典型微生物保藏中心
NCIB 英國國立工業細菌菌庫 CMI 英聯邦真菌研究所
IFO 大阪發酵研究所（日本） SSI 國立血清研究所
ATCC 美國典型培養物收藏中心 WHO 世界衛生組織
⑵ 母種的保藏方法有哪些
母種保藏的方法有很多種，具體採用哪種方法應根據實際情況而定。常用的基礎方法有：斜面繼代低溫保藏、自然基質保藏（麥穀粒保藏、發酵糞草保藏、木屑保藏、麥麩+木片保藏、木塊+瓊脂保藏、稻草粉保藏草菇菌種、枝條保藏）、液體保藏[礦油保藏、菌絲球生理鹽水保藏、蒸餾水保藏、營養液保藏、液氮保藏（圖2-12）]、孢子濾紙保藏、真空冷凍乾燥保藏、液氮超低溫保藏、孢子沙土管保藏、梭氏真空乾燥保藏等方法。專門保藏菌種的機構為確保保藏效果，每一品種都要同時用至少三種方法保藏，即長期方法、中長期方法和短期方法。限於篇幅，不再一一介紹。下面僅針對菇農介紹常用的低溫和基質保藏法及幾種土法保藏方法。
圖2-12 母種的液氮保藏法
（1）斜面繼代低溫保藏
這是一種傳統的、普遍應用的簡易保藏方法，它簡單易行，不需特殊設備，並能隨時觀察所保藏菌種的情況。其缺點是轉管頻繁，營養生長過多，易發生退化，在操作中發生技術錯誤的機會多；可能會因未及時轉接、培養基幹縮而引起菌種老化、死亡等。
這種方法是根據低溫能抑制菌絲生長的原理，將需要保藏的菌種接種在斜面培養基上，適溫培養，當菌絲健壯地快長滿斜面時取出，放2～5℃低溫乾燥處或冰箱、冰櫃中保藏。每隔一定時間要移植轉管、繼代培養1次（一般4～5個月），具體應根據菌種特性來確定。食用菌中有的中高溫和高溫型品種，不適於該法，如毛木耳多數品種保藏的適宜溫度在10℃左右，中華靈芝在6～10℃，草菇在10～12℃。可在草菇菌落上灌注3～4毫升的防凍劑（10%的甘油）。
用於保藏的培養基，不宜用營養過貧或過富的合成培養基，一般採用天然培養基，如馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）、馬鈴薯綜合培養基（CPDA）等。為防止產酸，糖應少加或不加，而需添加緩沖劑，如磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、碳酸鈣等，以中和菌種在保藏過程中產生積累的有機酸。同時，每1000毫升還需加 10毫克維生素 B1，加大瓊脂用量至25克，以防止培養基中水分蒸發過快。如保藏香菇和黑木耳菌種，把配方中的葡萄糖更換成麥芽糖更有利。棉塞稍長，入管內達3厘米左右，製成半高層培養基，即斜面小、短，管底1.5厘米的培養基呈柱狀。
橡皮塞密封保藏：選用與試管口相應大小的白橡皮塞，清洗、曬干，放入低壓聚乙烯袋內，於0.137兆帕下滅菌1小時。在無菌條件下，將培養合格的斜面菌種用無菌橡皮塞取代原棉塞，置4～6℃冰箱內保藏，保藏時間可達6個月以上。這種方法能隔絕空氣，防止蒸發，達到液體石蠟相似的效果。而且放置、郵寄、攜帶等很方便。
注意事項：
①保藏菌種必須是發育健旺的菌種，培養時間不可過長，以免降低菌種生活力。
②制種時要貼好標簽，每次移接時要細心核對菌種號及標明時間，做到准確無誤，若發現錯誤，應立即糾正，無法確認的，剔除不要。
③定期檢查保藏情況，一旦發現污染或培養基失水干縮現象，應立即移接、剔除。
④盡量少啟用冰箱，以免產生冷凝水而引起污染，開啟時應做到邊開、邊取、邊關，最好設置一個永久性的保藏冰箱，與常用菌種的冰箱分開。
⑤保藏菌種在冰箱中不可過分擁擠；保藏溫度控制在3～5℃，不宜過高或過低。
⑥冰箱要定期排霜，清除積水。保藏時要注意環境濕度不能太高，濕度太高，黴菌容易在棉塞上生長，並通過棉花纖維進入管內。所以，最好用橡皮塞或硅氧海綿塞代替。若用棉塞，可用干凈的紙（硫酸紙、牛皮紙均可）包紮好，也能起到減少污染、延緩培養基幹縮的作用。
⑦所保存的菌種在使用時，要提前12～24小時從冰箱取出，經適溫培養恢復活力後，方能轉管移接。
（2）自然基質保藏
即利用食用菌自然生長的培養基來保藏菌種的方法。常用的有麥粒、穀粒培養基、發酵糞草、木屑木片、麥麩米糠等基質。
①麥（谷）粒保藏 此法利用麥粒、穀粒或玉米粒（碾碎）等作為培養基，進入顆粒的菌絲體，在表皮的保護和穀粒中有限水分的供給下，保藏期可達1～2年。現以麥粒為例介紹如下：
先將麥粒洗凈，用20℃左右溫水浸泡5小時後撈出晾乾表面的水分（或置水中煮沸5分鍾至不破皮），裝入試管長度的2/3～3/4，塞好棉塞，置於1.18×105帕壓力下滅菌30分鍾。處理後麥粒的含水量不要超過25%，滅菌過程中勿使表皮破裂，以保護進入麥粒的菌絲體。滅菌後趁熱搖散麥粒，冷卻後，接種孢子液或菌絲懸浮液或菌絲塊，然後置25℃下培養，當試管快發滿菌絲後，即停止培養，保藏在乾燥冷涼處。
②木屑保藏 用闊葉樹木屑、麥麩加糖和石膏各1%，混合拌勻，加適量水後，裝入試管長度的2/3，稍壓緊，洗凈管口，塞上棉塞，用紙包好，置1.18×105帕壓力下滅菌40分鍾，冷卻後接種，置25℃條件下培養，菌絲長滿後將棉塞蠟封或換橡皮塞，再包紮塑料袋置4℃冰箱中可保藏1～2年。
（3）井底低溫保藏
即利用井底具恆溫且溫度低的原理進行菌種保藏的方法，適用於不具備保鮮冰箱的菇農。將要保藏的試管母種，用無菌橡皮塞醮石蠟封口，裝入密閉的廣口瓶或塑料袋中，扎緊，沉入井底貯藏，可保藏2～5個月。
（4）石蠟封口保藏
把蠟紙裁成6～8厘米見方，放75%酒精中浸泡1分鍾。將已培養好試管種的管口在酒精燈火焰上方旋轉滅菌後，用鑷子取出蠟紙，扎緊管口。再將包好蠟紙的管口浸入熔化的石蠟中，將蠟紙完全浸入為止，使蠟紙緊緊封包在管壁上，絕不漏氣。待石蠟冷卻凝固後，置冰箱或室溫下保存。
（5）玻璃紙封口保藏
用明膠15克（粘合劑），硫酸銅2克，美藍1～2滴（指示劑），溶於100毫升熱水中，配製成封口劑。將新長滿的母種拔去棉塞，管口朝下，蘸上封口劑，貼上用95%酒精浸泡過的玻璃紙（賽珞璐），再用石蠟熔封。在室溫下，菌種至少可保存8個月，並能防止黴菌或蟎的侵染。在斜面注入無菌礦油（液體石蠟），可大大延長保藏時間。
（6）廄肥保藏
此法適合保藏雙孢菇等草腐菌類。將腐熟牛糞等堆肥曬干、打碎，取300克干堆肥，用5毫米孔徑篩過篩，加1000毫升水調濕，裝入試管，占管深1/3～1/2，在0.15兆帕壓力下滅菌2小時。確認無菌後，接種，菌絲長滿後，放在3℃冰箱內保藏，每隔2年移植一次。在長期保藏中，如培養基失水，應將保藏菌種及時接種在瓊脂斜面上進行活化，再繼續保存。此法連續保藏4年後，其生產性狀未出現明顯變化。
⑶ 中國醫學微生物菌種保藏管理辦法
第一條組織及任務
在衛生部領導下，在中國微生物菌種保藏委員會指導下，設下列醫學微生物菌種保藏管理中心：
中國醫學真菌菌種保藏管理中心：由中國醫學科學院皮膚病防治研究所負責。
中國醫學細菌菌種保藏管理中心：由衛生部葯品生物製品檢定所負責。
中國醫學病毒菌種保藏管理中心：由中國預防醫學中心病毒學研究所負責。
保藏管理中心的任務是：
（一）負責本門類微生物菌種的選擇、收集、鑒定、保藏、交換和供應；
（二）開展菌種分類、鑒定及保藏管理的研究；
（三）組織學術交流和經驗交流；
（四）辦理國內外菌種交換；
（五）編制保管的菌種目錄。
保藏管理中心下設專業實驗室，承擔全國性的業務工作。專業實驗室對其直接領導機構和保藏管理中心負責，並定期向管理中心匯報工作情況。其具體任務是：
（一）負責本專業有關微生物菌種的選擇、收集、鑒定、保藏、交換和供應；
（二）承擔本專業有關疑難菌種鑒定；
（三）開展有關菌種分類、鑒定、保藏的研究，包括新技術、新方法的研究和應用；
（四）辦理對外交流和交換菌種。
各專業實驗室科研技術人員的編制和經費由所屬主管部門負責。
生物製品生產、檢定用的菌種按「生物製品生產、檢定用菌種、毒種管理規程」執行，統一由衛生部葯品生物製品檢定所辦理。第二條菌種的分類
菌種的分類根據其危險性決定（包括實驗室感染的可能性，感染後發病的可能性，症狀輕重及愈後情況，有無致命危險及有效的防止實驗室感染方法，用一般的微生物操作方法能否防止實驗室感染、我國有否此種菌種及曾否引起流行、人群免疫力等情況）。依其危險程度的大小，我國的菌種分為四類。
一類：實驗室感染的機會多，感染後發病的可能性大，症狀重並能危及生命，缺乏有效的預防方法，以及傳染性強，對人群危害性大的烈性傳染病，包括國內未發現或雖已發現，但無有效防治方法的烈性傳染病菌種。如：
鼠疫耶爾森氏菌、霍亂弧菌（包括EL－tor弧菌）；
天花病毒、黃熱病毒（野毒株）、新疆出血熱（克里米亞剛果出血熱）病毒、東、西方馬腦炎病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、拉沙熱（Lassa）病毒、馬堡（Marburg）病毒、埃波拉（Ebola）病毒、猴皰疹病毒（猴B病毒）；
粗球孢子菌、莢膜組織胞漿菌、杜波氏組織胞漿菌。
二類：實驗室感染機會較多、感染後的症狀較重及危及生命，發病後不易治療及對人群危害較大的傳染病菌種。如：
土拉弗郎西絲氏菌、布氏菌、炭疽芽胞菌、肉毒梭菌、鼻疽假單胞菌、類鼻疽假單胞菌、麻風分枝桿菌、結核分枝桿菌；
狂犬病病毒（街毒）、森林腦炎病毒、流行性出血熱病毒、國內尚未發現病人在國外引起腦脊髓炎及出血熱的其它蟲媒病毒、登革熱病毒、甲、乙型肝炎病毒；
各種立克次體（包括斑疹傷寒、Q熱）；
鸚鵡熱、鳥疫衣原體、淋巴肉芽腫衣原體；
馬納青黴、北美芽生菌、副球孢子菌、新型隱球菌、巴西芽生菌、煙麴黴、著色黴菌。
三類：僅具有一般危險性，能引起實驗室感染的機會較少，一般的微生物學實驗室採用一般實驗技術能控制感染或有對之有效的免疫預防方法的菌種。如：
腦膜炎奈瑟氏菌、肺炎雙球菌、葡萄狀球菌、鏈球菌、淋病奈瑟氏菌及其它致病性奈瑟氏菌、百日咳博德特氏菌、白喉棒桿菌及其它致病性棒桿菌、流感嗜血桿菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸埃希氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、空腸彎麴菌、酵米面黃桿菌、副溶血性弧菌、變形桿菌、李斯特氏菌、銅綠色假單孢菌、氣腫疽梭菌、產氣莢膜梭菌、破傷風梭菌及其它致病梭菌；
鉤端螺旋體、梅毒螺旋體、雅司螺旋體；
乙型腦炎病毒、腦心肌炎病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒以及未列入一、二類的其它蟲媒病毒、新必斯（Sindbis）病毒、濾泡性口炎病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、脊髓灰質炎病毒、腺病毒、柯薩奇（A及B組）病毒，艾柯（ECHO）病毒及其它腸道病毒、皰疹類病毒（包括單純皰疹、巨細胞、EB病毒水痘病毒）、狂犬病固定毒、風疹病毒；
致病性支原體；
黃麴黴、雜色麴黴、梨孢鐮刀菌、蛙類黴菌、放線菌屬、奴卡氏菌屬、石膏樣毛癬菌（粉型）、孢子絲菌。
四類：生物製品、菌苗、疫苗生產用各種減毒、弱毒菌種及不屬於上述一、二、三類的各種低致病性的微生物菌種。
對通過分子生物學方法產生的新菌株，應按其原始親本中的最高類別對待。
不允許進行兩個菌株完整基因組的重組試驗。
⑷ 防止菌種衰退的措施有哪些
（1）講究配料用於製作原種、栽培種的培養料其原料要新鮮；難吸水的培養料應先用足夠的水拌濕，充分拌勻後及時裝瓶（袋），上鍋滅菌，擱置時間不宜超過5小時。（2）細心裝料根據培養料性質、培養時間、滅菌方法等，選用合適的瓶或袋。培養料裝至離棉塞2～3厘米處，抹凈瓶（袋）口，然後加棉塞，以免水分和培養料把棉塞玷污。製作母種注入培養基時要細心，切勿將培養基沾在試管口上。管口棉塞要松緊適中，過松易進雜菌。（3）滅菌徹底在滅菌時試管要輕放，瓶（袋）擺放要留空隙，棉塞不能互相擠壓。根據培養料和容器裝置，確定滅菌蒸汽壓力（或溫度）及滅菌時間。注意排出冷空氣。放氣速度要慢。（4）無菌操作料袋滅菌後冷卻至不燙手時再搬動，可減少袋壁破裂。接種器具要保持潔凈，用前要消毒。每個環節都要嚴格按無菌操作規程進行。（5）精選良種選用無污染、菌絲生長健壯的適齡母種和原種。接種前認真檢查，並且不要用表層菌種接種。接種最好破開瓶底，從下部接至離表面2～3厘米處；若從瓶口取種，應把上層2～3厘米厚的菌種挖掉，然後接種。（6）凈化環境培養室要通風乾燥，啟用前要清掃、消毒。培養菌種期間，每天要適當通風。當空氣相對濕度大於70%時，要開吸濕機、空調機或用生石灰、木炭等降低室內濕度。（7）定期檢查接種後5～7天檢查1次是否有污染。污染雜菌的要及時揀出處理，並且找出原因，加以防治。搬動菌種瓶（袋）要小心輕放。同時還要預防老鼠、蟑螂等為害和帶入雜菌。
⑸ 敘述海藻提取物的定義、分類、功能及其對環境尤其是土壤的生態影響
海藻以60％～75％乙醇提取，除去大分子蛋白質、核酸。多糖以及脂質得到含氮的低分子物質如游離氨基酸、結合氨基酸、核著酸及其衍生物、生物鹼、磺酸以及有機酸、無機鹽等低分子物質一起被稱之為海藻提取物。
由於海藻富含多種生命活性物質，如多糖、高不飽和脂肪酸，牛磺酸、類胡蘿卜素、甾淳及海帶氨酸等，無論是作為日常食物，還是提取活性物質作為葯品，海藻對人類都有著極大的好處。
海藻自古以來就是葯有植物。在明代李時珍編寫的《本草綱目》中就已經列舉了海藻的葯用價值。人們日常生活中吃的紫菜，可治腳氣和咽喉腫痛；海帶可治大脖子病，這是民間流傳已久的方法。通過現代高科技手段，將海藻中的生命活性物質提取出來，合成葯物，為發展我國的傳統醫學提供了新的契機。海藻中的海藻多糖、多鹵多萜物質都具有提高人體免疫力、抗癌、抗病毒的活性。海藻多糖可以與HIV（人獲得性免疫缺陷病毒）結合，使其失活，從而抑制病毒的復制，防治愛滋病；海藻多糖還可以降低血管中導致動脈粥樣硬化的脂質含量，以及治療心腦血管疾病。螺旋藻中的β－胡蘿卜素可以保護人的視力。從深海魚油中提取的高不飽和脂肪酸EPA（二十碳五烯酸）和DHA（二十二碳六烯酸）具有提高大腦智力以及增強人體免疫力的功效，而在海藻中也可以提取出這兩種物質。因此，以海藻為原料，進行葯品生產，可以大大降低生產成本，從而提高經濟效益。
海藻的表面有一層極為濕潤的黏液，主要是用於退潮後保護海藻表面，防止日曬過度而造成死亡。根據這個原理，人們對這層黏液進行了研究，發現它是一種多糖類物質，具有極好的延展性能，將它製成化妝品，具有保濕、防曬的功效。現在市場上銷售的大寶SOD蜜中的主要物質是SOD，它的中文名稱叫做超氧化物歧化酶，可以防止由於過度日曬造成的皮膚表面氧化因子的活化，在海藻中也能夠提取出這種酶。
海藻不僅可以作為食品、葯物，還可以用於農業生產。海藻中含有吲哚乙酸、植物生長激動素、海藻酚等有機物質，用於種植業中作為肥料可以起到抗旱、抗鹽鹼滲透、耐寒、殺菌和促生長作用。將海藻製成肥料，不僅可降低成本、提高經濟效益，還可以去除農葯殘留物對人體造成危害。將海藻粉添加到飼料中，可以改善肉質、提高產量，並且能夠提高成活率，這主要是因為海藻的風味獨特，而且富含氨基酸和蛋白質。
海藻類肥料施用主要採用葉面噴施，市場產品大多稀釋1000倍左右，每畝噴灑量稀釋後約60kg，所需成本1--2元。試驗表明海藻類肥料具有明顯的促進生長效果，增產幅度達7．1％～26％。試驗還證明海藻類肥料使用不僅可增加作物產量，且還可改善作物品質，改善土質環境．避免土壤板結等。同時還在抗寒、抗旱和抗病等方面顯示出明顯的抗逆效果。由於海藻是生長在海洋中的低等光合營養植物，是海洋有機物的原始生產者，它除含有陸地植物所具有營養成份外，還含有許多陸地植物不可比擬的碘、鉀、鎂、錳、鈦等微量元素以及海藻多糖、甘露醇等，海藻中的特殊成份海藻多糖不僅能螫合重金屬離子，且能增加土壤透氣能力，同時海藻還含有種類繁多的維生索、含N化合物等，在農業上的應用，可減少化肥的使用量，有效改善生態環境。
⑹ 葯用真菌的分離培養與菌種保藏是什麼
（冉硯珠）
一、純菌種的分離培養
為了得到某種葯用真菌的純菌種，必須將它從其周圍的其他生物或微生物中分離出來。分離工作要根據葯用真菌的特性，從分離方法、培養基的種類、培養條件的控制以及在培養基中是否添加某種抑制劑等等綜合考慮，否則達不到分離菌種的有效目的。純菌種的分離方法大致有三種：組織分離、孢子分離及寄主分離。
（一）組織分離法
利用幼嫩組織中的菌絲，在無菌條件下，接種在培養基上，重新恢復為沒有組織分化的菌絲體，這種方法分離得到的菌種生命力強，菌絲生長快，得到純菌的生活率較高。此法適應范圍較廣，特別是對有些孢子不易萌發或萌發速度不一致的種類以及菌核、菌索等組織，採用此法為宜。
進行組織分離，事先要對分離材料進行選擇，要求材料必須是品系純正，品質優良，幼嫩肥壯而無病蟲害，然後進行表面消毒處理。先用清水洗凈外面沾附的泥土或雜物，放入無菌操作室（櫃）中的無菌器皿內，用表面消毒劑（如0.1—0.2%升汞、10%漂白粉、70—75%酒精、5%來蘇兒或2%甲醛等）溶液浸泡一定時間。消毒時間要根據消毒劑的特性和菌體組織的質地、大小而定。一般如菇類（香菇、蜜環菌）鮮嫩的組織，消毒時間要短，控制在0.5—1.0分鍾，這樣既不會傷害組織又能達到組織表面殺菌的目的；像表皮組織比較厚的豬苓菌核，在5%的來蘇兒溶液中泡半小時以上，不致影響生活力。升汞溶液殺菌力較強，組織經表面消毒後，必須再經無菌水沖洗，去掉附著的殘留葯物，以免影響菌體萌發生長。無菌水沖洗後要用滅菌濾紙吸去沾附的水分，用無菌刀將組織切割成約0.5cm2小塊，分別放置在預先滅過菌而裝有培養基的培養皿或試管中，一般每皿5塊左右，排開保持一定間隔，試管內僅放1塊為宜。培養時將皿底朝上，置24—28℃恆溫下培養數天，組織塊周圍就可長出新的菌絲，再經純化即可得到純菌種。
表面消毒時，如方法掌握不當或無菌操作不嚴格，往往會造成污染，消毒過度則菌體本身生活力喪失而分離不出純菌種，分離多孔菌類或菌肉較肥厚的傘菌類真菌，也可不用葯劑浸泡，只要用70—75%酒精棉塗擦外皮後，去掉表皮，挑取內部組織塊直接進行分離。為了防止細菌感染，可將要分離的組織小塊用0.1—0.5%金黴素（或鏈黴素）浸蘸一下再移置。為防止培養基上污染細菌可在每毫升培養基內加入0.125mg氯黴素，因它較前兩種穩定、耐高溫，可與培養基一同高壓滅菌。
分離葯用真菌時，通常使用的培養基成分如下：
馬鈴薯（去皮） 200g（切碎煮沸半小時過濾去渣）
蔗糖 20g
磷酸二氫鉀 3g
硫酸鎂 1.5g
維生素B1 10mg
瓊脂 18g（加水至1000ml）
除上述培養基外，也常用沙氏培養基或馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂培養基。
（二）孢子分離法
這是利用葯用真菌的菌褶或菌孔中著生的孢子，使其在無菌條件下彈射在適合生長的培養基上，並萌發生長成菌絲而得到純菌種的一種方法。這種方法在香菇、銀耳、茯苓等葯用真菌中分離應用。
葯用真菌的有性孢子，都是由異性的細胞核，經核配後形成的，具雙親的遺傳性，變異性大，生命力強，適於育種工作採用，為防止雜菌感染，分離材料要嚴格消毒，對於子實層未外露的子實體，可浸入0.1—0.2%升汞溶液中2—3分鍾進行表面消毒。子實層外露的如香菇，為避免孢子殺傷，需用70—75%酒精對菌蓋、菌柄進行表面消毒，把子實體切去菌柄，插在金屬絲製成的支架上，一並放入培養皿中，外面套以玻璃缸或鍾形罩，經數小時後在培養皿內就可以收集到大量的孢子。此外也可以採取懸掛法。如銀耳，將耳瓣用清水洗凈後，放入無菌三角瓶或大試管內，以無菌水振盪沖洗三次，取出放於無菌玻皿內，用濾紙吸去多餘水分，剪一片耳瓣在滅過菌的細鐵絲鉤上，然後懸掛在倒有一薄層培養基的三角瓶中，耳瓣距基面2—3cm。在24—26℃下，經1—2天培養，就可在基面上隱約可見到白色孢子。再繼續培養2—3天就可以形成乳白色糊狀突起菌落。即銀耳芽孢菌種。由於這樣得到的菌種在木屑上菌絲不能萌發，故不能直接作為瓶栽的菌種。
茯苓菌擔孢子分離是在其子實體發射孢子雲時採用。用空中捕捉法，以試管口對准孢子雲，使孢子落入試管培養基上。或用附著法，即使上升的孢子雲附著在培養基上面，在25℃下培養。
如果以雜交育種為目的，要採用單孢子分離法。利用單孢子分離器進行單孢子分離，是目前先進手段，但設備昂貴，國內只有少數單位使用。較為廣泛應用的是菌液連續稀釋法。其方法是用無菌水把孢子沖散，最大限度地降低孢子在無菌水中的分布密度，最後使每滴水中只含1—2個孢子。然後用無菌注射器吸入孢子懸浮液，滴在斜面基表面，轉動試管，菌液便均勻分布在斜面上，經適溫培養，選優良菌落進行純化。異宗結合擔子菌的單孢子分離物，雖然可繁殖菌絲，但不會形成子實體，故不能用於栽培生產。
（三）寄主分離法
此法也稱基內菌絲分離法。這是利用生長某種葯用真菌菌絲的基質做分離材料而獲得純菌種的一種方法。一般只有在上述兩種方法不能達到目的的情況下應用。被選做種子的子實體，若孢子已釋放完畢，子實體開始乾枯或腐爛，菌絲失去活性，難以用孢子分離及組織分離法得到純菌種，或某些品種子實體的質地為膠質（銀耳、木耳）、革質（雲芝）、木栓質（靈芝）、木質（針裂蹄）等類群均可採用此法。
選擇菌木的標准：生長的子實體性狀優良，基內菌絲發育旺盛，菌木未腐爛無雜菌污染。為防止細菌污染，除使用酸化培養基或加入抗菌素外，應使菌木風干失水。如耳木、菇木及苓木。以銀耳為例，選好耳木後，在子實體生長的部位，削下1—1.5cm厚的菌木一片，去掉樹皮，把菌木片放入0.1%升汞液中浸泡幾分鍾表面消毒，沖去葯液，吸干表面水分，放入無菌室（櫃）的培養皿內，切去木片外層，將中間生長菌絲的部分，用無菌刀切成0.5cm2大小小塊，放入培養基表面進行適溫下培養和純化移植。
由於葯用真菌種類不同，所形成的菌落外觀及結構也各有差異。因此鑒定所分離的菌種，除根據經驗外，更確切的是經過一段培養，待形成一些特殊結構，如菌絲束、菌核、菌索，尤其是子實體和孢子後方可判斷。
二、菌種的保藏與復壯
葯用真菌菌種是國家的重要資源與天然財富。也是葯用真菌生產與科研的基礎。葯用真菌的「種」不同，其葯用價值及培養條件也不同，就是同一「種」的不同菌株，也同樣有差異。在生產實踐中要選用符合生產要求的菌種，應具備葯效好，生產周期短、產量高、生活力強等特點。對有效成分明確的，應選用含量高的菌株，對有效成分未確定的，應選葯理作用顯著，無毒性反應及臨床療效好，產量高的菌種。生產上也可以根據一定的目的要求，應用菌體的自然變異加以選擇，不斷鞏固其特性育成新菌株或人為的定向培育改良菌種特性。如通過雜交或誘變育種選擇優良菌株，使生產或有效物質含量達到新的水平。
一個品系純正、品質優良的菌種，常由於管理不善和傳代過多以及貯藏方法不當等原因，而引起優良性狀的退化，這種現象稱為菌種退化。為防止菌種性狀的退化或恢復已經發生退化的菌種原有性狀，應採取科學的保藏方法與有效的復壯措施。
（一）菌種的保藏方法
葯用真菌菌種在乾燥低溫、冷凍或減少氧氣含量等條件下保藏，使其代謝強度降低，維持菌種的休眠狀態，就可防止菌種退化。
1.斜面低溫保藏
除草菇等個別屬高溫型菌種，適於在15℃左右條件下保藏外，絕大多數種類都適合於低溫保藏。即把保存的菌種放於4—5℃左右冰箱中，經3—6個月轉管傳代一次。為恢復菌種的生活能力，需在使用前1—2天從冰箱中取出，置於常溫下進行活化轉管，不能直接使用。
2.礦物油封藏法
將上述斜面菌種，灌注一層滅菌的液體石蠟油，在三角燒瓶中滅菌時由於有蒸汽進入，會影響所保存菌種的質量，因此需要放在40℃溫箱中使水蒸氣蒸發後再使用。冷石蠟油用無菌吸管注入，注入量要足夠覆蓋整個斜面並高出培養物1cm，試管口棉塞用玻璃紙或塑料布包緊，放置冰箱或室溫保存。這種保存方法可以防止培養基失水及外界空氣進入，可降低新陳代謝，保持菌種活力，從而起到延長菌種使用壽命的效果。從石蠟管中挑取菌絲移置到新斜面上活化培養，以後可供生產用。此法可保存菌種1—2年不喪失活力。
3.冷凍乾燥法
此法是採用真空、乾燥和低溫三結合保藏菌種的方法，保存期可長達10—20年。具體方法：將保存真菌的孢子製成懸浮液，裝入安瓶管中，然後驟然降溫冷凍，並抽出空氣成真空狀態，使培養物以固體狀態升華脫水，熔封瓶口後，在低溫或室溫下保存。
4.液氮超低溫保藏法
超低溫能使代謝機能降低到最低水平而菌種不發生變異。實驗證明，採用這種新技術可以保藏所有的微生物菌種。液氮超低溫冰箱內的溫度可達-196—-130℃。超低溫保藏菌種具高效、使用范圍廣、操作簡便等優點，但儀器價格昂貴，應用尚不普遍。
除上述幾種保藏菌種方法外，還發現靈芝菌（赤芝、薄蓋靈芝）在麥麩及小米斜面上，於低溫（4℃左右）保存一年多仍具有生命力。若保存管的棉塞換以橡皮塞則可保存達4年以上。
（二）菌種復壯
葯用真菌的種類繁多，生物特性各異，任何一個選育出來的優良品種，都常因多次傳代培養，長期進行人工培養或長期保藏而不進行轉管以及保藏條件不適等，菌種就會發生自然變異，出現退化現象。
菌種退化的主要表現有，菌絲體生長緩慢，子實體性狀變壞，產量下降以及有效成分降低等。過多次傳代，會由於菌絲長期處在活躍的營養生長狀況，生命繁衍受到抑制，因此傳代次數應控制在2—3次之間。已經產生退化的菌種，有必要繼續保留和應用時，則必須進行菌種復壯。進行菌種復壯時，除應改善培養條件外，對已馴化的栽培種類，最可靠的方法就是進行有性繁殖（孢子分離）。
銀耳菌絲菌種，經多次傳代後會出現生活力弱，出耳率低的退化現象。可利用加入芽孢的方法復壯菌種。即取芽孢試管1支注入10ml無菌水，將芽孢懸液接入鋸木屑菌種中，這樣菌種出耳率會得到提高。芽孢菌種在木屑基中不能萌發菌絲，如加上1—2%過磷酸鈣和1—2%骨粉則可萌發菌絲。用重新接種原寄主的方法也可起復壯作用。
⑺ 菌種保藏應控制的條件
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1一般菌種都是厭氧型,所以不需要氧氣
2培養基不能是乾燥的
3空氣中含其他細菌,會污染培養基
4菌種不進行光合作用,不需要光
5適當的低溫,降低細菌代謝,有利於保藏
⑻ 常用的菌種保存方法有哪些
菌種保藏是食用菌產業的一項基礎工作，是確保野生種質資源基因留存和現有生產用種遺傳性能相對穩定的必要手段。菌種保藏的方法多種多樣，有的雖然保藏效果好，但投資高或操作繁雜。在生產實踐中，更需要設備投入少，能保障菌種不死亡、不污染、最大限度地保持優良種性的簡便方法，如斜面低溫短期保藏和自然基質較長期保藏相結合的方法。
一般而言，對母種進行長期保存，對原種進行短期保存。須保證優良菌種的性狀和活力不發生變異，不死亡，不被污染，確保其純度。因此，保存方法應具備取材容易、操作方便、菌種不易退化、長期保存不污染雜菌等優點。常用的菌種保存方法如下：
（一）斜面低溫保藏 該法的優點是保藏方便且所佔空間較小。具體做法是：菌絲長滿斜面後，放在0～5℃保存。以後每隔一定時間（2～3個月）轉管一次。轉管保存不能長期用PDA培養基，否則種性易退化，灰樹花降解木質纖維素的能力減弱。因此隔一定時間（1年左右）須把菌種轉接到木屑培養基上復壯，之後挑選健壯無污染的菌絲再轉回PDA培養基保存。在長期保存過程中，要防棉塞受潮滋生雜菌。菌種試管口最好用蠟燙封，以防培養基內水分過快蒸發。增加瓊脂用量（2.5%～3%）可減緩水分蒸發。還要防止菌種管上的標簽脫落而造成種系混雜。
斜面低溫保藏方法簡便易行，能隨時觀察保藏菌株的活力和純度，一旦染雜，肉眼能及時發現。
（二）自然基質保藏 此法是根據灰樹花的特性，利用自然基質保藏其菌種的方法。灰樹花是木腐菌，可以採用以木屑為主料的培養基。自然基質營養全面，且大部為緩釋養分，不易產生營養過剩或飢餓；其次，培養基理化性狀好，可吸收或緩沖菌絲代謝出的有害物質，水分與通氣協調平衡，部分菌絲扎入基質內生長，不裸露於空氣中，菌絲呼吸強度低，生命力強。
1.原料與配方 粗、細木屑比例適當，採用板栗樹木屑最佳，粗木屑粒徑為2毫米左右，細木屑為一般圓盤鋸屑，粗、細的比例為1∶2，添加干木屑重量20%的麩皮和1%的糖，含水率為60%左右。這樣的基質通氣性好，營養豐富且供菌絲分解利用的時間長，長到基質內部的菌絲比包裹在基質外部暴露於空氣中的菌絲耐受性強。不同粒徑的基質比例適當，還能協調氣與水的矛盾。粗粒過多，架空菌絲多；細粒過多，透氣性差，菌絲生長慢。應用配方如下：
栗木屑78%，麩皮20%，石膏1%，蔗糖1%，水65%配料，裝入較粗大的試管中，裝料量為試管的1/3～1/2，1.5千克/厘米2滅菌1.5小時。冷卻後，接入需保藏的菌種，在28℃下培養，待菌絲長滿木屑培養基時取出換上無菌橡皮塞，在0～5℃冰箱內保藏1～2年轉管一次。
2.容器與裝量 採用容量250毫升的葡萄糖玻璃瓶，清洗潔凈，裝量一般不超過玻璃瓶容量的3/5，填料不能過滿，瓶壁所殘留的顆粒須擦拭乾凈，否則保藏的菌種易引起污染。
3.滅菌和冷藏 滅菌時若採用棉塞封口，基質表層易失水，接種成活率低，即使菌絲復活，生長也很緩慢，所以最好採用聚丙烯膜封口，接種後換用無菌棉塞培養，待菌絲長滿後再換成有孔滅菌膠塞冰箱保藏。
用上述方法保藏的菌種經3年貯放後，接出成活率均達90%以上，出菇驗證產量及子實體形態特徵均無明顯變化。因此，自然基質保藏法具有保存期長，菌種遺傳性能相對穩定的特點。
（三）木粒PDA斜面保藏 灰樹花在自然狀態下易發生於栗樹根部，這說明其營養需求較為特殊。根據灰樹花這種習性，在PDA基礎上添加適量的栗樹木粒製成母種培養基。在多年的使用中發現，用該培養基培養的母種生長勢好，在轉接原種時，適應能力強，萌發定植快；用作菌種保藏基質時，保藏時間長，並能很好保持菌種的優良性狀。
1.木粒PDA的製作 選取栗樹邊材，加工成0.3～0.5厘米的顆粒，及時烘乾或曬干備用。稱取葡萄糖10克，KH2PO41克，1溶解於1升清水中配製成營養液。將營養液倒入盛有木粒的小鋁鍋中，營養液以完全浸沒木粒為准。煮沸10分鍾，以加快木粒對營養液的吸收速度，起鍋靜置30分鍾讓木粒吸足營養液。撈出木粒，瀝掉表面的水，裝入試管，裝量為試管長的1/6，最多不得超過試管長的1/5，否則在擺制斜面時，不易使木粒均勻分散於斜面的表面上。
選取新鮮的馬鈴薯，去皮並切成薄片，稱取200克放入小鋁鍋中，加入1升清水，文火煮沸30分，趁熱過濾取汁，並補足1升的體積。稱取瓊脂20克，葡萄糖20克，KH2PO4 2克，MgSO47H2O 2克。先將瓊脂剪碎，加入到馬鈴薯濾液中，繼續用文火加熱，使瓊脂溶化。待瓊脂完全溶化後，加入稱好的其他3種營養成分，攪拌使這些物質溶解均勻，趁熱裝入已裝有木粒的試管中，裝至試管長的1/3處，塞上棉塞。
在0.8～1千克/厘米2蒸氣壓下滅菌40分，待氣壓降至0時，開蓋取出，趁熱輕輕抖拍試管，使木粒分散後即可擺制斜面，並使木粒呈半裸狀分布於斜面上，待凝固後便製成了木粒PDA培養基。
2.生長及保藏效果 木粒PDA斜面上培養的灰樹花母種，菌絲生長迅速、良好，12天即可長滿試管，但菌絲的後期生長勢更為粗壯、濃密，後勁足。轉接原種時，菌種適應力強，定植快。這表明，灰樹花菌絲的生長速度、生長勢不僅取決於本身的遺傳性，而且很大程度上取決於培養基的營養。常規PDA的營養成分，主要是可溶性的速效性營養，前期營養豐富，營養利用直接，因而前期菌絲生長迅速、良好，後期營養則不足，菌絲生長不良，長勢欠佳。木粒PDA由於在增添了木粒這一緩效性營養，就木腐性的灰樹花而言，營養配伍合理，補充了菌絲生長後期所需的營養，因此後勁足。
菌絲體對基質的分解利用是通過菌絲細胞分泌的胞外酶，將基質中的大分子營養分解成小分子營養後才被吸收利用的，而這些胞外酶大多為誘導酶，其合成與分泌受基質的誘導和分解產物阻遏機制調節。就纖維素酶而論，許多易代謝碳源（如葡萄糖等）具有引起酶合成阻遏作用，同時伴隨著菌絲體的旺盛生長，酶的大量合成則出現在易代謝碳源基本耗盡之後，且受到基質纖維素的誘導，常規PDA基質，到葡萄糖等易代謝碳源基本耗盡的後期，由於營養的缺乏，菌絲生理機能下降，酶的合成量減少。而木粒PDA不僅含有易代謝碳源——葡萄糖，又含有木粒這一緩效性營養，前期葡萄糖促進了菌絲體旺盛生長，獲取了大量的菌絲體，表現為菌絲粗壯、濃密。到了易代謝碳源耗盡的後期，木粒一方面補充了後期所需的營養，使菌絲的生埋機能維持在一定的水平；另一方面木粒的纖維素激活菌絲細胞纖維素酶的誘導機制，合成了大量的酶，保持了木腐生性灰樹花較強的分解木材的能力，因此，用該培養基培養的母種在轉接原種時適應力強，萌發定植快。因部分菌絲長入木粒內部，抵抗不良環境的生存能力增強，種質不易退化。木粒PDA灰樹花菌種，在0～5℃保藏2～3年再轉管活化，成活率仍達到90%左右。此外，木粒PDA應用於木腐性灰樹花種的提純復壯，效果也較理想。
（四）石蠟隔氧封藏 具體做法是將液態石蠟分裝入三角瓶內，裝量達瓶空間的1/3，塞好棉塞，於121℃滅菌2小時，然後置40℃溫箱中，使其水分蒸發，或置於乾燥器內數日以除去水分，石蠟呈透明狀為宜。在無菌條件下，用無菌吸管裝入已長好菌絲的斜面試管，使液面高出斜面頂部1厘米左右。塞上無菌橡皮塞，豎直保存。此法可使菌種存活3年以上，但以1～2年移植一次為好。移植時不必倒出石蠟，用接種鉤取一塊菌絲即可。因轉移時帶有石蠟，菌絲生長弱，需要再轉管1～2次，方能復壯。